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新奥霉素(Xinaomycin)是链霉菌XiAo-3(streptomyces XiAo-3)产生的一种新的具有广谱抗病毒活性的尿嘧啶核苷类抗生素,对人畜毒性低,具有工业开发潜力。本文对菌株XiAo-3发酵液的理化性质和分离提取发酵液中新奥霉素的工艺技术进行了研究,建立了新奥霉素的检测方法,主要取得了以下结果:
确定了硅胶柱层析提取新奥霉素的方法。新奥霉素发酵液经用盐酸调pH3.0-4.0后,过滤,得到预处理后的发酵液。再用吸附树脂脱色,最佳静态脱色条件为:pH3.0-4.0,树脂用量与待处理发酵液体积比(g/ml)为1:5,30℃,200r/min,振摇2h;最佳动态脱色流速为4BV/h,脱色率可达94.70%,而新奥霉素的抗菌生物活性收率为98%。脱色液用乙醇沉淀除去杂蛋白,进行两次硅胶柱层析,可以分离纯化得到新奥霉素,经HPLC检测峰面积为98%。
确定了离子交换吸附提取新奥霉素的方法。采用大孔离子树脂AB-8处理经脱色处理脱色后的发酵液,离子交换提取最佳条件:采用强酸性阳离子交换树脂JK008作为离子交换吸附剂,发酵液的上样pH7.0,流速为1BV/h,使用1%氨水进行解析,解析流速为4BV/h,活性总收率70%以上,最后减压浓缩干燥得新奥霉素固体粉末产品。
建立了新奥霉素分析检测方法,包括生物活性测定法和高效液相色谱法。①新奥霉素生物活性定量检测:以四环素为对照标准,采用一剂量管碟法测定。新奥霉素的四环素当量效价标准线,y=3.848x-1.780,R2=0.993。②新奥霉素的高效液相色谱法分析:通过对多种色谱柱的筛选,以及改变流动相的比例,缓冲液的浓度和酸碱度,经过优化后的色谱条件是:Aglient HC-C18(4.6×250mm),流动相:5%甲醇(0.05%冰乙酸),紫外检测波长:λ=265nm,柱温40℃,进样量51.tl,流速0.5ml/min。
新奥霉素水剂的稳定性研究表明:新奥霉素水剂分别在40℃、60℃和80℃条件下,保温90 min后,发酵液的抑菌活性无明显变化;用酸对新奥霉素水剂处理后,其活性有微小的上升,而用碱处理后,抑菌活性有所下降;经254nm紫外光照射30min,60min,90min,120min,抑菌活性无明显变化。存储稳定性的结果表明,新奥霉素水剂在冷冻条件下保藏两周活性基本没有变化,加速保藏实验的结果表明新奥霉素水剂存放时间越长其生物活性降低越明显。