葡萄糖和脂质代谢紊乱,是导致糖尿病和心血管疾病的主要危险因素。当今,糖尿病和心血管疾病已经成为全球死亡率最高的疾病。噻唑烷二酮类药物是目前用于治疗糖尿病的经典药物,其可以通过激活PPARγ而有效地调节糖代谢,但也有导致体重增加、脂质聚积和组织损伤等副作用。而最著名的治疗心血管疾病的药物,他汀类药物,在有效降低血清中胆固醇水平的同时,也表现出一系列的副作用,如肝损伤、肌肉损伤和高血糖等。因此,开发新型改善葡萄糖和脂质代谢,并且副作用较小的药物仍十分迫切,并具有非常好的前景。Sirtuin 1(SIRT1)是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,在控制能量代谢,压力反应、血管保护和衰老方面起着关键性作用。Kruppel样因子2(KLF2)是一种重要的具有锌指结构的转录因子,KLF2通过其在内皮细胞中的抗炎,抗血栓形成,抗氧化以及调节增殖作用来维持内皮细胞稳态和正常功能。鉴于SIRT1和KLF2的血管保护作用,调节SIRT1和KLF2活性或表达可能会成为治疗糖尿病和心血管疾病的新策略。然而,目前用于调节SIRT1或KLF2活性的小分子药物还鲜有报道。鉴于此,我们进行了靶向SIRT1和KLF2的小分子药物的筛选、药理学作用和机制研究。第一部分以SIRT1为靶标的糖脂代谢调节药物筛选及分子药理学研究SIRT1可参与介导热量限制影响各种生物的代谢和衰老的过程。最近的研究表明,增强SIRT1的活性或表达也可发挥调节葡萄糖和脂质代谢的作用。本研究第一部分工作旨在寻找能够调控葡萄糖和脂质代谢的新型SIRT1小分子激活剂。本室前期利用已建立的SIRT1激活剂高通量筛选模型进行筛选,得到一个新的SIRTI激活剂E6155。E6155是一种哌嗉1,4-二酰胺类化合物,首次被发现为SIRT1的小分子激活剂。在体外实验中,化合物E6155以SIRT1依赖的方式降低SIRT1底物p53的乙酰化水平,证明了化合物E6155的确为SIRT1的激活剂。我们进一步研究发现,化合物E6155通过增加SIRT1去乙酰酶的活性而显著上调人正常肝细胞和大鼠骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取。在二型糖尿病KKAy小鼠中,化合物E6155可以显著降低小鼠的空腹血糖水平。同时,化合物E6155可明显改善二型糖尿病小鼠的口服葡萄糖耐量异常和胰岛素耐量异常。葡萄糖钳夹实验和HOMA-IR指数评估显示化合物E6155可以增强二型糖尿病小鼠的胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗。机制研究表明,化合物E6155改善胰岛素抵抗,调节葡萄糖代谢的作用涉及到SIRT1依赖的LKB1/AMPK和IRS1/AKT信号通路的激活。这一研究结果确定了化合物E6155是一种新型SIRT1激活剂,并提示其可能成为一种治疗胰岛素抵抗和糖尿病的药物候选物。通过高通量筛选,我们还得到另外一个哌嗪1,4-二酰胺类化合物E1231。筛选模型的量效曲线显示,化合物E1231显著上调SIRT1的活性,EC50为0.83 μM。前期表面等离子体共振实验表明,化合物E1231能够以剂量依赖的方式与重组人SIRT1蛋白相互作用,显示出较强的亲和力。体外实验显示化合物E1231以SIRT1依赖的方式显著降低SIRT1底物p53的乙酰化水平,而免疫共沉淀实验证明化合物E1231可以使LXRα发生去乙酰化,这些都证实化合物E1231的确为SIRT1的激活剂。化合物E1231可以通过激活SIRT1和LXRα上调小鼠巨噬细胞中与胆固醇代谢相关的ABCA1的表达。体外功能实验表明化合物E1231通过SIRT1和ABCA1显著促进细胞内胆固醇的流出并且抑制巨噬细胞中的脂质聚积。在金黄地鼠高胆固醇血症模型中,化合物E1231可以显著降低血清和肝脏中总胆固醇和甘油三酯的水平,并增加粪便中的胆固醇含量,参与调节体内胆固醇逆转运的过程。机制研究表明,化合物E1231可显著提高金黄地鼠肝脏中SIRT1和ABCA1蛋白的表达。在ApoE-/-小鼠模型中,化合物E1231可显著减少小鼠主动脉和心脏流出道动脉粥样硬化斑块的发生。通过这一研究确定了化合物E1231是一个新型的SIRT1激活剂并阐明了其对脂质和胆固醇代谢的有益作用。第二部分以KLF2为靶标的脂代谢调节药物筛选及分子药理学研究转录因子Kruppel样因子2(KLF2)是血管内皮中一种重要的抗炎和抗动脉粥样硬化的血管保护分子。增强KLF2的活性或表达可以改善内皮功能并预防动脉粥样硬化的发生。在本研究的第二部分,我们构建了基于KLF2启动子萤光素酶报告基因检测的高通量筛选模型,通过筛选以期得到新型KLF2激活剂。通过对化合物库(美国罗切斯特大学)中的2 400个化合物进行筛选,我们确定了一个被美国FDA批准为有效抗癌药物的HDAC抑制剂SAHA为有效的KLF2激活剂。我们通过体外研究发现SAHA表现出较强的抗炎作用并可显著抑制TNFα诱导的单核细胞与内皮细胞的粘附。通过分离KLF2缺陷小鼠的肺内皮细胞及使用KLF2 siRNA,进一步研究表明SAHA对内皮炎症以及单核细胞粘附的抑制作用依赖于其上调KLF2的活性。确定了 SAHA的体外抗炎作用后,我们进一步采用ApoE-/-小鼠模型,SAHA口服灌胃给药,以评估其抗动脉粥样硬化的作用。结果发现,SAHA可显著降低高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的病变发展,而对其血脂水平没有显著影响。这些结果表明,SAHA在内皮细胞中具有KLF2依赖性的抗炎作用,提示SAHA可能成为动脉粥样硬化的有效治疗药物。通过KLF2激活剂高通量筛选模型,我们还获得了一个多酚类化合物Tannic Acid(TA)。研究表明TA通过作用于ERK5/MEF2信号通路来上调内皮细胞中KLF2的表达。功能研究显示,TA通过降低粘附分子VCAM1的表达而显著降低单核细胞与内皮细胞的粘附。使用从KLF2缺陷小鼠体内分离的肺内皮细胞,我们发现TA的抗炎作用依赖于对KLF2表达的上调。研究结果表明,TA是一种有效的KLF2激活剂,可以通过上调KLF2的表达而抑制内皮炎症。同时我们的研究结果还为TA已确定的心血管保护作用提供了一种新的机制解释,并为激活KLF2可能是动脉粥样硬化等心血管疾病有希望的治疗策略提供了理论支持。综上所述,通过使用基于SIRT1和KLF2的高通量筛选模型,我们发现了一系列新型SIRT1和KLF2激活剂。我们的结果阐明了 SIRT1和KLF2激活剂对调节葡萄糖和脂质代谢的有益作用,并且揭示它们可能成为治疗糖尿病和动脉粥样硬化等代谢综合征的新型药物。