川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）以根茎入药,为四川省著名道地药材,主要用于治疗偏头痛、风湿性关节痛、月经失调、跌打损伤、心血管疾病等,其指标成分为阿魏酸。现代研究证明阿魏酸及其衍生物有保护神经系统、镇痛、抗氧化、抗血栓、抗动脉粥样硬化、抗癌等功效。川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶（L.chuanxiong caffeic acid-3-O-methyltransferase,LCCOMT）以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基基团供体,能催化咖啡酸形成阿魏酸。前期研究中,实验室构建了LCCOMT-pET28a重组质粒,转入BL21菌株中,优化了重组菌株的表达纯化条件,并通过HPLC检测LCCOMT活性。首先,本研究在最佳条件下诱导表达LCCOMT重组蛋白,利用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化的LCCOMT蛋白浓度进行测定。选用LiCl、NaCl和KCl为效应物,证明碱金属离子Li⁺、Na⁺和K⁺浓度在0-1.0 mM范围内对LCCOMT酶活力影响较小。选用CoCl₂·6H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Pb（NO₃）₂、NiSO₄·6H₂O、CdCl₂、FeSO₄·7H₂O、CaCl?·2H₂O、Ba Cl₂·2H₂O和MnCl₂·4H₂O为效应物,证明Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺和Cd²⁺浓度在0-1.0 mM范围内均能使LCCOMT酶活力降低,其中以Cu²⁺最为明显;而Fe²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺和Mn²⁺浓度在0-1.0 mM范围内对LCCOMT酶活力影响较小。选用Bi（NO₃）₃·5H₂O、Al（NO₃）₃·9H₂O、FeCl₃·6H₂O和CrCl₃·6H₂O为效应物,证明Bi³⁺浓度在0-1.0 mM范围内能使LCCOMT酶活力降低;而Al³⁺、Fe³⁺和Cr³⁺浓度在0-1.0 mM范围内对LCCOMT酶活力影响较小。通过研究Cu²⁺、Zn²⁺对LCCOMT紫外可见吸收光谱和荧光光谱的影响,发现Cu²⁺、Zn²⁺确实能使LCCOMT的三维结构发生改变。这些都为LCCOMT的后续固定化研究及工业化使用提供指导。其次,实验采用包埋固定化法,选用海藻酸钠作为载体固定化LCCOMT,以固定化酶的相对酶活力作为固定化效率的衡量指标。先后通过单因素实验和正交试验确定最佳固定化工艺条件为:海藻酸钠质量分数为2.0%,CaCl₂浓度为2.5 g/L,固定化时间为1 h,海藻酸钠溶液与酶质量比为35000:1,固定化效率可达75.43%。实验比较了游离LCCOMT和固定化LCCOMT的最适反应pH、最适反应温度、pH稳定性、热稳定性和米氏常数,结果为:游离LCCOMT和固定化LCCOMT的最适反应pH分别是7.0和7.5,固定化LCCOMT的最适反应pH升高0.5;游离LCCOMT和固定化LCCOMT的最适反应温度均是37℃,其最适反应温度没有变化。虽然固定化LCCOMT对pH的稳定性没有提高,且对底物的亲和力有所降低,但对热稳定性有所提高。在操作稳定性实验中发现固定化LCCOMT连续进行6次反应,固定化LCCOMT的相对酶活力可保留50%;在连续进行12次操作以后,固定化LCCOMT的相对酶活力仍可保留30%左右,说明制备的固定化酶的操作稳定性良好,能达到多次使用的目的。最后,利用聚乙二醇4000的亲水性,制备具有多孔结构的固定化酶,使固定化LCCOMT的相对酶活力比对照组提高33%左右。实验达到使固定化酶与反应产物容易分离、便于工业生产中自动化操作和降低酶的使用成本的目的。最后,构建了LCCOMT-pET28TEV-pccdB重组质粒,转入大肠杆菌Rosetta,成功表达了带有His标签和TEV蛋白酶酶切位点的目的蛋白LCCOMT,利用Ni²⁺柱亲和层析、分子筛凝胶过滤层析纯化得到纯度大于95%的LCCOMT。采用商业化试剂盒（Index、Screen、PACT、WIZARD、JCSG I、JCSG II、JCSG III、JCSG IV）进行了结晶条件系统初筛,共获得多个结晶条件,然后进行优化。LCCOMT晶体结构是以alfalfa Caffeic Acid/5-hydroxyferulic acid 3/5-O-methyltransferase的结构（PDB ID:1KYW）为模型通过分子置换法解析获得。LCCOMT-SAM复合物晶体衍射最高分辨率为1.8?,LCCOMT-SAH复合物晶体衍射最高分辨率为1.95?,空间群为P 2₁。每个不对称单位中有2个分子,每个分子包含18个α螺旋和9个β折叠及连接这些结构的loop,并且结合一个SAM或SAH。与SAM形成氢键的LCCOMT氨基酸残基为:D230、D250、M251、K264;与SAH形成氢键的LCCOMT氨基酸残基为:S183、G207、D230、D250、M251、K264。通过与其他同源序列比对,发现这些残基均非常保守,实验更加准确的解释了LCCOMT的作用机制。