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黄大茶(Large yellow tea)是一种具有浓烈锅巴香味的轻微发酵茶,产于安徽省霍山和湖北省英山等地。黄大茶价格低廉、具有独特茶香和干爽的口感,富含茶多酚、茶多糖和蛋白质等多种生物活性成分,具有一定的营养价值和药理活性。本文将黄大茶与有效微生物(Effective Microorganisms;EMs)相结合,利用EMs发酵黄大茶,得到有效微生物发酵黄大茶提取物(FLYT)。通过体外抗氧化实验和建立小鼠急性肝损伤模型评价FLYT的抗氧化能力和肝保护作用。主要研究内容如下:1.FLYT的制备及提取工艺优化:黄大茶经粉碎、EMs固态发酵、乙醇预处理、热水浸提、减压浓缩、离心、乙醇沉淀、溶解、减压浓缩、冻干等步骤得到FLYT。响应面实验设计得到FLYT提取的最佳工艺参数:提取时间2.2 h;提取温度78℃;液料比21:1。最优条件下FLYT的实际得率为6.69±0.59%。三个因素对FLYT得率的影响程度为:液料比>时间>温度。2.EMs发酵后FLYT主要成分变化和体外抗氧化能力:苯酚硫酸法、考马斯亮蓝法和福林酚法检测分析发现FLYT和LYT(黄大茶提取物)的主要成分为糖类、蛋白质和茶多酚。LYT糖含量为28.76%,蛋白质含量为38.79%,茶多酚含量为13.78%;FLYT糖含量为40.97%,蛋白质含量为27.93%,茶多酚含量为12.14%。EMs发酵后FLYT中的糖含量增加,蛋白和多酚含量减少,且产生了分子质量较小的多糖组分。抗氧化实验结果表明FLYT对DPPH、OH-和ABTS+有着很高的清除率,150μg/mL的FLYT对DPPH、OH-和ABTS+的清除率可以达到85%以上,显著高于LYT。3.FLYT对酒精导致的急性肝损伤的保护作用:小鼠灌胃低、中、高剂量FLYT 30天后,按12 mL/kg体重给予50%的酒精建立小鼠急性肝损伤模型。测定血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量评价FLYT对酒精导致的肝脏脂代谢紊乱的改善作用;分析血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的含量及肝脏病理切片评价FLYT对酒精导致的肝损伤的缓解作用;检测酒精代谢酶及抗氧化酶活力、丙二醛(MDA)含量和炎症因子表达水平进一步评价FLYT对酒精性肝损伤的抑制作用。实验结果表明,FLYT能显著改善酒精导致小鼠肝脏脂代谢紊乱;提高了小鼠肝脏酒精代谢酶和抗氧化酶的活力;改善小鼠体内的炎症状态;组织病理学切片证实FLYT能显著改善酒精诱导的肝损伤。同一剂量下FLYT 比 LYT效果更显著。4.FLYT对酒精诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用机制:测定核因子E2相关因子2(Nrf2)及下游过氧化氢酶(CAT)、Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和醌氧化还原酶1(NQO-1)的相对表达量,结果显示FLYT能活化肝损伤小鼠体内Nrf2因子并上调下游CAT、Cu/Zn-SOD和NQO-1的表达,对酒精诱导的小鼠肝损伤起到保护作用。