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结核分枝杆菌是典型的胞内寄生菌,其磷脂代谢途径在结核分枝杆菌的各种代谢途径中具有重要的作用,结核分枝杆菌Rv0183主要与结核分枝杆菌的磷脂代谢有关。结核分枝杆菌脂类含量占细胞壁干重的60%,并且有大量的分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面。其磷脂代谢在结核分枝杆菌的各种代谢途径中具有重要的作用。研究发现,结核分枝杆菌Rv0183虽然没有水解溶血磷脂的活性,但可以将宿主细胞的中性脂类水解成单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油,这在结核分枝杆菌感染宿主细胞的过程中起到重要的作用。有关Rv0183与宿主细胞相互之间的作用及其生物学效应,尚属未知。为了研究结核分枝杆菌Rv0183的生物学效应及其功能,我们构建了pEGFP-N1-Rv0183真核表达载体,利用lipofectamine2000将其转染到小鼠肺泡巨噬细胞RAW264.7细胞系中,并利用实时荧光定量PCR对RAW264.7细胞因子的表达情况进行检测。
1.以结核分枝杆菌的DNA为模板,通过PCR的方法扩增克隆Rv0183基因,并进行了核苷酸序列测定。结果表明,核苷酸序列与GenBank上所公布的序列相似性为100%。成功的构建了pEGFP-N1-Rv0183真核表达载体,并利用脂质体和电转染方法转染RAW264.7细胞中。利用荧光显微镜观察和Western-Blotting检测,结果显示,pEGFP-N1-RV0183在RAW264.7细胞中成功表达。并且通过G418筛选获得了稳定表达的结核Rv0183细胞株。
2、将转染了pEGFP-N1-Rv0183和pEGFP-N1(对照)利用Real-timePCR方法检测,结果显示,Rv0183可以引起RAW264.7细胞IL-6、NF-κB、Toll-Like Receptor2和Toll-LikeReceptor6表达上调(P<0.01)。由此说明Rv0183能够引起宿主细胞发生炎性反应。Rv0183转染小鼠肺泡巨噬细胞后,分别利刚Hoechst染色试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示,鼠肺泡巨噬细胞凋亡在短期内并不是很明显,而在7天以后出现了明显的凋亡(P<0.05)。