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第一部分外源性线粒体的提取和功能研究目的:有研究显示,细胞或组织上提取的线粒体可以保持其原有的活性和功能,维持其原有的完整性。同时也发现,啮齿动物细胞系中分离的线粒体可以成功地注射到同源性的卵母细胞或者单细胞胚胎中。这里我们用重组质粒编码珊瑚虫红色荧光蛋白2与人类细胞色素C氧化酶中线粒体靶向序列的融合蛋白(Plasmid encodes a fusion of Discosoma sp.Red fluorescent protein and the mitochondrial targeting sequence from subunit VIII of human cytochrome C oxidase,p Ds Red2-Mito),用以转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO),提取特异性标记的线粒体,观察其功能和对神经细胞的选择性。方法:用重组质粒p Ds Red2-Mito转染并单克隆CHO细胞,以构建稳定表达红色荧光线粒体的鼠源性细胞株(Mitochondria-CHO,Mito-CHO)。荧光检测线粒体在Mito-CHO细胞内的表达情况。另外,组织上提取线粒体,荧光检测肝源性线粒体提取后被Mito Tracker?Deep Red FM标记的情况。从Mito-CHO细胞中分离线粒体,运用JC-1(检测线粒体膜电位的荧光探针)试剂盒检测线粒体提取后的膜电位改变。细胞荧光观察不同来源的外源性线粒体进入原代培养神经细胞的选择性。激光共聚焦显微镜层扫进一步检测外源性线粒体进入大鼠皮层星形胶质细胞的情况。结果:细胞荧光结果显示,单克隆并扩大培养后的Mito-CHO细胞株可以完全表达红色荧光标记的线粒体;而且Mito Tracker?Deep Red FM可以标记小鼠肝脏线粒体。JC-1法检测线粒体提取后的膜电位,发现线粒体提取后与CHO细胞(Con:100±12.64%,n=3)中的线粒体膜电位一致(Mito:99.24±5.39%,n=3,p>0.05 vs control),即提取后的线粒体膜电位正常。细胞荧光观察发现,从Mito-CHO细胞以及小鼠肝脏上提取的线粒体均可以进入大鼠皮层星形胶质细胞。这种作用具有细胞选择性,即Mito-CHO细胞上提取的线粒体仅能进入大鼠皮层星形胶质细胞和小胶质细胞,而不能进入大鼠皮层及海马神经元。激光共聚焦显微镜层扫进一步观察外源性线粒体进入大鼠皮层星形胶质细胞的情况发现,外源性线粒体确实是进入到细胞内,而不是附着在胞膜外。结论:Mito-CHO细胞中提取的线粒体功能没有改变。外源性线粒体对培养的神经细胞具有选择性,只能进入大鼠皮层星形胶质细胞和小胶质细胞,而不能进入大鼠皮层及海马神经元。第二部分外源性线粒体对大鼠皮层星形胶质细胞的作用目的:线粒体参与星形胶质细胞的ATP供能、离子缓冲、谷氨酸氧化等过程,在神经系统疾病如抑郁症、认知、自闭症和精神分裂症等中发挥重要作用。这里我们主要研究外源性给予线粒体后对星形胶质细胞的活性和功能的影响。方法:荧光检测Mito-CHO细胞上提取的线粒体进入大鼠皮层正常星形胶质细胞的浓度和时间梯度。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法确定H2O2损伤星形胶质细胞的孵育条件。JC-1法检测外源性线粒体对正常和H2O2损伤的星形胶质细胞膜电位的影响。再用MTT法检测外源性线粒体对星形胶质细胞活性的影响。末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL)法检测外源性线粒体对正常和H2O2损伤的星形胶质细胞凋亡情况的影响。细胞迁移实验检测外源性线粒体对星形胶质细胞划痕损伤的保护作用。结果:荧光观察外源性线粒体进入正常星形胶质细胞的浓度依赖性发现,在一定范围内,外源性线粒体给予越多,进入细胞内的数量也就越多,其中1×106个细胞给予24μg线粒体孵育24 h,大部分外源性线粒体已进入星形胶质细胞。MTT法研究发现,给予400μM H2O2(Con:100±13.40%;400μM:48.95±5.40%,n=5,p<0.01 vs control)以及H2O2孵育1 h(Con:100±21.92%;1 h:38.97±13.12%,n=7,p<0.05 vs control)显著损伤星形胶质细胞。JC-1法检测外源性线粒体进入细胞后的膜电位改变,发现正常(Con:100±6.16%;Con+Mito:92.35±2.56%,n=3,p>0.05 vs control)和H2O2损伤(H2O2:78.02±7.36%,n=3,p<0.01 vs control;H2O2+Mito:78.89±13.65%,n=3,p>0.05 vs H2O2)的星形胶质细胞给予外源性线粒体前后的线粒体膜电位均不受影响。通过MTT法检测发现,外源性线粒体对正常(Con:100±20.35%;Con+Mito:95.66±28.35%,n=5-6,p>0.05vs control)和H2O2损伤(H2O2:90.07±18.76%,n=6,p<0.05 vs control;H2O2+Mito:83.94±15.51%,n=6,p>0.05 vs H2O2)的星形胶质细胞的活性无影响;其中与Con组相比,由于与孵育外源性线粒体24 h平行操作,导致H2O2组细胞活性稍有下降,可能因为细胞活性于24 h后稍有恢复。运用TUNEL法检测外源性线粒体对正常和损伤星形胶质细胞凋亡情况的影响,发现外源性线粒体对正常星形胶质细胞的凋亡情况无影响(Con:100±33.56%;Con+Mito:107.78±15.40%,n=3,p>0.05 vs control),而可以明显改善H2O2损伤模型的凋亡情况(H2O2:1316.4±115.47%,n=3,p<0.01 vs control;H2O2+Mito:390.48±128.84%,n=3,p<0.01vs H2O2)。通过细胞划痕实验研究外源性线粒体对正常和损伤星形胶质细胞的保护作用,结果显示,划痕24 h后,预先给予外源性线粒体的星形胶质细胞迁移的细胞数(Con:100±8.73%;Mito:157.56±13.89%,n=3,p<0.01 vs control)比未加线粒体的Scratch组迁移的细胞数多。结论:每1×106个细胞给予24μg外源性线粒体在37oC、5%CO2中孵育24 h,大部分线粒体能进入星形胶质细胞。正常和H2O2损伤的星形胶质细胞给予外源性线粒体前后的线粒体整体膜电位均没有改变;外源性线粒体对正常星形胶质细胞的凋亡情况无影响,但可以明显改善H2O2损伤模型的凋亡情况;此外,外源性线粒体有促进星形胶质细胞疤痕愈合的作用。