肠道类器官,可以模拟体内肠组织,能够在体外重现肠绒毛隐窝结构和功能的新型多细胞模型,在条件苛刻肠道病毒分离、病毒细胞趋向性、先天免疫系统对肠道病毒感染反应等方面研究具有一定优势。猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）和猪代尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）均为猪肠道冠状病毒,引起仔猪腹泻病,严重困扰生猪产业健康发展。本研究旨在建立猪肠道类器官体外培养系统,并进一步考察PEDV和PDCoV体外感染猪类器官后产生的免疫反应与传统IPEC-J2细胞感染模型的差别。结果为进一步研究猪肠冠状病毒的致病机理和抗病毒方法奠定了基础。1.猪肠三维和二维类器官培养体系建立研究针对猪十二指肠、空场和回肠隐窝,分别建立了三维化和二维化猪肠类器官体外连续培养方法。结果显示,来自三个肠段的所有隐窝经2天培养后逐渐形成圆形细胞簇,随后圆形细胞簇生长为含芽体的多叶结构。十二指肠的来源的类器官的EdU 阳性细胞比例（p<0.001）和克隆形成效率（p<0.001）显著高于其他两个肠段。空肠类器官体外连续14次传代以及复苏对其形态上没有明显变化。2-D类器官接种在预涂有0.25%基质胶的96孔板,约在3天内长成紧密的上皮层,并可见吸收细胞、内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞和干细胞等多种细胞亚群。类器官分化后,从第0天到第3天MPIEs分化后,肠道干细胞（CD326 阳性和CD44阳性）的频率从85.8%降低到55.1%。第1天到第3天,干细胞标记基因Lgr5的相对表达水平降低了 10倍以上,而上皮细胞（如肠内分泌细胞ChgA,杯状细胞TFF3和肠上皮细胞L-Fabp）的标记分子的转录水平和Paneth细胞Lyz基因被不同程度上调。而+4干细胞标记基因Bmi1和增殖抗原Ki67相关基因的转录中未见明显变化。2.猪肠类器官用于PEDV和PDCoV的体外感染模型的评估IFA和qPCR结果显示PEDV和PDCoV均可以感染猪肠二维化类器官,并在感染24 h后均诱导储存干细胞标记基因Bmi1和杯状细胞标记基因TFF3显著上调,这暗示两类病毒对于类器官存在类似的增殖分化调节能力。PDCoV在第2、8和14代次的类器官中的复制动力无明显差异,其中Sox9和Villinl 阳阳性肠上皮细胞可能是该病毒感染的靶细胞。在感染PDCoV的肠类器官中,粘膜免疫和抗病毒相关的基因转录变化显著高于IPEC-J2细胞。我们得出结论,源自猪空肠的二维肠类器官可作为体外多细胞感染模型,用于研究发病机理和对猪肠病原体（例如PDCoV）的宿主免疫反应。综上所述,研究成功建立了具有多细胞亚群的猪肠类器官体外连续培养方法。PEDV和PDCoV均可感染猪肠二维化类器官,Sox9和Villin1阳性肠上皮细胞可能是PDCoV感染的靶细胞。类器官在PDCoV感染后可以比IPEC-J2细胞诱导更强的粘膜免疫和抗病毒相关的基因转录,为进一步研究猪肠冠状病毒的致病机理和抗病毒方法奠定了基础。