论文部分内容阅读
背景非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致,与遗传-环境-代谢有密切关系的,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。主要包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、非酒精性脂肪性肝纤维化和肝硬化。近年来,随着人们生活习惯和饮食结构的改变,NAFLD发病率不断上升且有低龄化趋势,已成为21世纪全球性公共健康问题之一。非酒精性脂肪肝的整体发生率在西方国家达到20%-30%,在亚洲发生率为12%-24%,并且在过去的十五年迅速地增长,但它的发病机制尚未完全阐明。最近研究显示,肝组织 PPAR α(Peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPAR α),PGC-1 α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha,PGC-1 α)和UCP-2(Uncouplingprotein,UCP-2)基因的表达水平与NAFLD的形成及发展有密切相关,尤其PPARα和PGC-1 α信号通路直接参与褐色和白色脂肪代谢活动,促进脂肪和能量代谢,从而减少肝脏脂质沉积。目前全世界范围内还缺乏疗效确切、安全稳定的治疗NAFLD的药物,因此研究民族药物中寻找干预PPAR α和PGC-1 α信号通路,促进脂肪代谢,达到治疗NAFLD目的的药物是具有创新性。非酒精性脂肪肝属于蒙医"通拉嘎未消化症"范畴。"通拉嘎未消化症"是主要因过度食用油腻、凉性、不易消化食品等诱因而引起清浊生化功能紊乱所致的肝内脂肪聚积为特征的疾病。光明盐四味汤自古为治疗"通拉嘎未消化症"的首选经典方,而资料显示在降脂,促进脂肪代谢等方面有一定效果,尤其君药成分荜茇、干姜在脂肪代谢、糖代谢及抗氧化方面均有较强的调节作用。本实验阐明光明盐四味汤促进脂肪代谢,抑制肝脏内脂肪沉积的分子机制,为临床更确切广泛使用光明盐四味汤及从蒙药中研发治疗NAFLD的新药提供科学依据。目的观察光明盐四味汤对非酒精性脂肪肝模型小鼠体重、肝指数、肝细胞脂肪变、肝功能、血脂代谢等的影响及对脂肪细胞PPAR α、PGC-1 α及UCP-2基因mRNA表达的影响,验证光明盐四味汤对非酒精性脂肪肝的治疗功效。方法实验一.选取80只健康雄性C57BL/6n小鼠,进行一周适应性饲养后按体重随机分组,分为空白对照组(15只小鼠)和高脂模型组(65只小鼠)。空白对照组给予普通饲料,高脂模型组给予高脂饲料(Research Diets D12492 60 kcal%Fat)喂养。12周后从空白对照组和高脂模型组各随机选取3只小鼠,进行肝组织形态学观察,证实肝脏内形成的脂肪沉积水平,评价C57BL/6n小鼠NAFLD模型复制程度。模型复制成功后,将高脂模型组小鼠再随机分为模型对照组、硫普罗宁组(阳性对照组)、光明盐四味汤组(观察组)等三组,均继续予以高脂饲料喂养,空白对照组继续予以普通饲料喂养。从第13周开始,空白对照组和模型对照组给予蒸馏水10ml/Kg/d灌胃,阳性对照组予以硫普罗宁56mg/kg/d灌胃,观察组予以光明盐四味汤0.45g/Kg/d灌胃,持续4周。于实验17周后进行麻醉,取小鼠血清及肝脏组织标本。称小鼠体重和肝脏重量,计算肝指数,全自动生化仪检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转肽酶(Y-GT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。进行HE染色和Oil red染色评价各组小鼠肝组织病理改变。实验二.3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,将其随机分为空白对照组、PBS组(阳性对照组)、光明盐四味汤高、中、低剂量组(观察组)等五组。空白对照组不添加任何药物,PBS液组添加10%的PBS缓冲液,光明盐四味汤低、中、高剂量组分别添加低剂量(5mg/ml)、中剂量(15mg/ml)和高剂量(20mg/ml)光明盐四味汤,在培养瓶内相同的条件下分别进行48小时培养后,提取脂肪细胞内的总RNA和蛋白。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测PGC-1 α、PPAR α及UCP-2基因的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测PGC-1α和UCP-2蛋白质表达。所有数值以均数土标准误差表示,采用SPSS19.00软件进行t检验,当P>0.05吋,认为观察组和对照组之间有显著性差异。结果实验一 1.与空白对照组相比,模型组肝脏的Oil red染色程度鲜明且染色面积广,硫普罗宁组肝脏的被染程度稍微变弱且有面积变小的趋势,光明盐四味汤组的被染色程度明显浅于硫普罗宁组和模型组,且被染区域面积小。2.与空白对照组相比,模型组肝脏系数明显升高,有显著性差异(P<0.05);与模型组相比,光明盐四味汤组和硫普罗宁组肝脏系数明显下降且有显著性差异(P<0.05);与空白对照组相比,模型组血清中的ALT、AST明显升高且有显著性差异(P<0.05);与模型组相比,硫普罗宁组血清中的ALT、AST明显下降且有显著性差异(P<0.05);但模型组相比,光明盐四味汤组血清中的ALT、AST无显著差异(P>0.05);血清γ-GT在各组之间无显著性差异(P>0.05);与空白对照组相比,模型组血清中的TC、TG明显升高且有显著性差异(P<0.05);与模型组相比,光明盐四味汤组血清中的TC、TG明显下降且有显著性差异(P<0.05);但与模型组相比,硫普罗宁组血清中的TC、TG无显著性差异(P>0.05)。实验二1.RT-PCR检测结果示:与空白对照组相比,PBS液组脂肪细胞PGC-1a基因的mRNA表达明显增高且有显著性差异(P<0.05);与PBS液组相比,光明盐四味汤组中、高剂量组脂肪细胞PGC-1α基因的mRNA表达明显增高且有显著性差异(P<0.05);与空白对照组相比,PBS液组脂肪细胞PPARα基因的mRNA表达无显著性差异(P>0.05);与PBS缓冲液组相比,光明盐四味汤组中、高剂量组脂肪细胞PPAR α基因的mRNA表达明显增高且有显著性差异(P<0.05);与PBS液组相比,光明盐四味汤各组脂肪细胞UCP-2基因的mRNA表达无显著性差异(P>0.05),随着光明盐四味汤用药量的增加UCP-2基因的mRNA表达有下降的趋势。2.Western Blot检测结果示:与空白对照组相比,PBS液组PGC-1 α蛋白表达无明显增强(P>0.05);与PBS液组相比,光明盐四味汤高剂量组PGC-1 α蛋白表达明显增强(P<0.05);与PBS组相比,光明盐四味汤组UCP-2蛋白表达随着光明盐四味汤用药量的增加有降低趋向。结论1.光明盐四味汤可有效降低非酒精性脂肪肝模型小鼠的肝湿重和肝指数,减轻肝组织内脂肪沉积。2.光明盐四味汤对非酒精性脂肪肝小鼠模型有明显的降脂和抑制肝组织内脂肪沉积的作用,并且降脂作用优于硫普罗宁肠溶片。3.光明盐四味汤可激活PPAR α/PGC-1 α信号通路,纠正肝脏脂质代谢紊乱。4.光明盐四味汤主要通过促进脂肪细胞PPARα及它的受体PGC-1α的合成,上调PGC-1α蛋白表达,从而促进能量及脂肪代谢,阻止细胞内的脂肪沉积。