【研究背景】卵巢癌是女性生殖器官常见的三大恶性肿瘤之一,恶性度高,早期诊断困难,多数患者就诊时已属晚期,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。卵巢癌细胞具有高的增殖及转移潜力,然而对其恶性生物学行为机制尚不明确。因此研究卵巢癌的恶性生物学行为机制,寻找新的治疗靶点,成为亟待解决的任务。氯离子通道广泛分布于有机体的细胞膜及细胞器膜,其在细胞的容积调节、物质的跨膜转运、细胞电位、细胞器的酸化、细胞增殖分化等多种生理过程中发挥重要作用。氯离子通道在体内的调控受多种因素的的影响,根据功能及门控机制,氯通道可分为:电压门控性氯离子通道（Voltage-gated chloride channels,CLC）、容积调控性氯离子通道（Volume-regulated/sensitive anion/chloride channels,VRAC）、囊性纤维化跨膜传导调节体（Cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator,CFTR）、钙激活性氯离子通道（Calcium-activated chloride channels,CLCA）、配体激活的氯离子通道（ligand-activated chloride channels）。配体激活的氯通道主要分布于神经系统。氯离子通道参与多种细胞的增殖,氯通道阻滞剂对诸如肝细胞、肺主动脉内皮细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞等多种细胞的增殖具有抑制作用。引人瞩目的是:近年多项研究发现氯离子通道在多种肿瘤中表达异常,并且氯通道可能在肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学行为中起着重要作用。例如:CLC氯通道在脑胶质瘤组织和细胞中过表达,这有利于细胞大小和形状的改变,从而导致瘤细胞易于分裂和侵袭狭窄的细胞外脑间隙;容积调控性氯离子通道是调节鼻咽癌细胞通过G₁期限制点,促进细胞增殖的重要因子;还有研究报道其在肿瘤细胞中呈细胞周期依赖性改变。CLC-3是CLC氯离子通道的重要家族成员,并且CLC-3又是容积调控性氯离子通道最有可能的候选蛋白,所以其功能复杂多样,有研究报道前列腺癌细胞中抗凋亡调节因子呈剂量依赖性上调CLC-3蛋白表达水平,使细胞生存能力提高而抗凋亡。另有研究发现抑制CLC-3蛋白表达后,肿瘤细胞的侵袭转移能力降低。迄今为止,国内外尚未见氯离子通道在卵巢上皮性癌细胞中的表达情况及其对卵巢上皮性癌细胞增殖及细胞周期的影响。因此我们研究的目的是观察氯通道在卵巢上皮性癌细胞中的表达、探索氯离子通道在卵巢上皮性癌细胞增殖及细胞周期中的作用以及CLC-3单通道改变对卵巢癌细胞增殖的影响。第一部分氯离子通道在卵巢上皮性癌细胞中的表达及其在细胞增殖及细胞周期中的作用目的:观察氯离子通道在卵巢上皮性癌细胞株A2780中的表达,探讨氯离子通道在卵巢癌细胞株A2780增殖及细胞周期中的作用。方法:采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测几种有代表性的氯离子通道mRNA在卵巢上皮性癌细胞中的基因表达;应用免疫细胞化学方法检测氯离子通道蛋白在A2780细胞中的表达。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法,观察不同浓度及种类的氯离子通道阻滞剂阻断卵巢癌细胞氯离子通道后,卵巢癌细胞株A2780增殖活力的变化;采用流式细胞仪技术检测不同浓度及种类的氯离子通道阻滞剂阻断卵巢癌细胞氯离子通道后,卵巢癌细胞A2780细胞周期的变化。结果:RT-PCR检测提示卵巢癌细胞株A2780表达CLC-3及CFTR氯离子通道mRNA;但未检测到hCLCA-2 mRNA表达。免疫细胞化学染色显示卵巢癌细胞A2780表达CLC-3及CFTR氯离子通道蛋白,蛋白表达定位于细胞质膜。MTT检测表明不同浓度的氯通道阻滞剂NPPB、NFA、TAM作用细胞后明显抑制了A2780细胞的增殖活力。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的NPPB对A2780细胞的抑制率分别为23.4%、59.2%、90.8%及93.5%,各浓度组与对照组相比差异均有显著性（P＜0.05）。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的NFA对A2780细胞的抑制率分别为18.3%、40.9%、68.6%及75.1%,各浓度组与对照组相比差异均有显著性（P＜0.05）。10μmol/L、20μmol/L及30μmol/L的TAM对A2780细胞的抑制率分别为65.8%、73.4%及77.5%,各浓度组与对照组相比差异均有显著性（P＜0.05）。而相对特异性CFTR氯通道阻滞剂Glibenclamide作用细胞后对A2780细胞的增殖活力无明显影响。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的Glibenclamide对A2780细胞增殖的抑制率分别为2.1%、2.8%、3.7%及3.9%,各浓度组与对照组相比,差异无显著件（P＞0.05）。流式细胞仪检测发现不同浓度的氯离子通道阻滞剂NPPB、NFA、TAM作用A2780细胞72 h后,细胞周期的G₀/G₁和S期细胞分布均发生改变,细胞周期停滞于G₀/G₁期。而Glibenclamide作用A2780细胞后,细胞周期的G₀/G₁和S期细胞分布改变无统计学差异。1 NPPB对A2780细胞周期的影响50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的NPPB作用于A2780细胞后:细胞周期的G₁/G₁期细胞数由55.4±2.1%分别增加到73.1±3.9%、84.2±2.3%及86.5±2.6%,各浓度组与对照组相比,差异均有显著性（P＜0.05）。S期细胞数由34.0±2.5%分别下降至22.3±4.1%、12.1±2.3%及10.7±1.6%,各浓度组与对照组相比,差异均有显著性（P＜0.05）。2 NFA对A2780细胞周期的影响50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的NFA作用于A2780细胞后:细胞周期的G₀/G₁期细胞数由55.4±2.1%分别增加到69.3±3.5%、74.6±2.1%及79.5±3.6%,各浓度组与对照组相比,差异均有显著性（P＜0.05）。S期细胞数由34.0±2.5%分别下降至24.1±1.5%、18.7±1.9%及13.4±2.7%,各浓度组与对照组相比,差异均有显著性（P＜0.05）。3 TAM对A2780细胞周期的影响10μmol/L、20μmol/L及30μmol/L的TAM作用于A2780细胞后:细胞周期的G₀/G₁期细胞数由55.4±2.1%分别增加到68.7±2.4%、73.8±3.3%及79.4±3.1%,各浓度组与对照组相比,差异均有显著性（P＜0.05）。S期细胞数由34.0±2.5%分别下降至24.6±1.9%、20.3±2.2%及15.3±1.6%,各浓度组与对照组相比,差异均有显著性（P＜0.05）。4 Glibenclamide对A2780细胞周期的影响50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的Glibenclamide作用于A2780细胞后:细胞周期的G₀/G₁期细胞数由55.4±2.1%分别改变为55.8±2.9%、53.1±3.2%及54.2±3.5%,各浓度组与对照组相比差异均无显著性（P＞0.05）;S期细胞数由34.0±2.5%分别改变为33.7±2.6%、36.9±1.6%及35.6±2.8%,各浓度组与对照组比较差异均无显著性（P＞0.05）。结论:CLC及CFTR氯离子通道在卵巢癌细胞系A2780中表达。电压门控性氯离子通道及容积调控性氯离子通道可能在卵巢上皮性癌细胞的增殖及细胞周期中起着重要作用。第二部分CLC-3反义寡核苷酸对卵巢上皮性癌细胞增殖的抑制作用及其机制目的:观察电压门控性氯离子通道-3（CLC-3）反义寡核苷酸转染对卵巢上皮性癌细胞A2780增殖及细胞周期的影响。方法:以脂质体Lipofectamine介导的CLC-3反义寡核苷酸转染卵巢上皮性癌细胞株A2780,利用Western blot检测转染CLC-3反义寡核苷酸后A2780细胞CLC-3蛋白表达的变化;通过MTT法、流式细胞仪检测细胞增殖能力及细胞周期的变化。应用Western blot检测CLC-3反义寡核苷酸转染对卵巢癌细胞A2780细胞周期素D1（CyclinD1）表达的影响。结果:卵巢上皮性癌细胞A2780转染CLC-3反义寡核苷酸后,CLC-3的蛋白表达明显降低。50μg/ml和100μg/ml CLC-3反义寡核苷酸对CLC-3蛋白表达抑制率分别为62.5%及78.6%。而100μg/ml CLC-3正义寡核苷酸转染对CLC-3蛋白的表达未见明显影响。CLC-3反义寡核苷酸转染48 h后降低了A2780细胞的增殖能力,50μg/ml、100μg/ml反义CLC-3寡核苷酸对A2780细胞增殖的抑制率分别为48.6%及65.3%,与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）;而100μg/ml CLC-3正义寡核苷酸转染对A2780细胞的增殖能力的影响与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。流式细胞仪检测结果表明CLC-3反义寡核苷酸转染A2780细胞48 h后,细胞周期分布发生改变,处于G₀/G₁细胞数目上升,S期细胞数下降。50μg/ml、100μg/ml的CLC-3反义寡核苷酸组G₀/G₁期细胞数由49.4±3.1%分别上升至70.3±3.4%和75.8±2.6%,与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）;而S期细胞数由40.3±2.8%分别下降至23.5±2.1%和19.6±1.5%,与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。而转染正义寡核苷酸对A2780细胞的细胞周期无明显影响,100μg/ml CLC-3正义寡核苷酸转染A2780细胞后,G₀/G₁期细胞数由49.4±3.1%改变至50.2±3.6%,S期细胞数由40.3±2.8%改变至39.7±2.9%,与对照组相比差异均无显著性（P＞0.05）。Western blot检测显示CLC-3反义寡核苷酸抑制了A2780细胞的CyclinD1蛋白表达;而CLC-3正义寡核苷酸对A2780细胞CyclinD1的蛋白表达未见明显影响。结论:CLC-3反义寡核苷酸能够抑制卵巢上皮性癌细胞的增殖能力,CLC-3氯离子通道可能成为卵巢癌治疗的新靶点。CLC-3氯离子通道可能通过对CyclinD1的调控发挥其在卵巢上皮性癌细胞增殖及细胞周期中的作用。