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三氯乙烯(Trich Loroethy Lene,TCE)是一种工业上广泛使用的有机溶剂,同时也是一种重要的环境污染物。其可通过多种途径进入人体,肝脏作为其主要的代谢场所,三氯乙烯代谢物蓄积于肝脏,导致肝毒性发生或引发肝损伤,严重者甚至发生肝衰竭或死亡。对TCE致肝细胞毒性的作用机制了解尚浅。SET基因在肝细胞和乳腺癌细胞中高表达,其自身作为一种原癌基因,参与了生物体内多种重要的生理过程:例如细胞凋亡,转录过程,染色体复制等。课题组前期研究筛选出SET差异表达蛋白,初步研究了SET相关的表观遗传调控因子对TCE致肝细胞毒性效应的影响,检测了TCE作用下肝细胞中基因组整体甲基化变化情况。但SET相关的表观遗传调控机制是如何解释TCE诱导肝细胞毒性效应这一问题尚待研究,本论文将进一步研究SET基因启动子甲基化变化对TCE致肝细胞毒性效应的作用机制,及初步探索SET相关的mi RNA调控能否解释TCE致肝细胞毒性效应的发生机理。方法和结果 本课题从以下两方面开展研究:研究1:TCE作用下肝细胞中SET基因启动子区甲基化检测分析方法:培养L-02肝细胞,使用不同浓度的TCE(0 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L)处理L-02细胞24 h,提取细胞基因组DNA,用亚硫酸氢盐试剂盒进行修饰,设计引物后进行PCR扩增,分子克隆和测序。结果及结论:与对照组相比,TCE处理的L-02肝细胞中SET基因启动子区甲基化水平下降,且随着TCE染毒浓度的增加,SET基因启动子区甲基化水平递减。对甲基化差异位点进行分析发现,p<0.05的差异甲基化位点有73个,这些位点中已知序列名称的有24个;位于转录因子结合区的差异甲基化位点有9个,这些位点上均有多个已知的转录因子结合。差异甲基化位点的出现限制了转录因子的结合,造成染色体结构稳定性改变,导致SET基因表达异常,验证了SET蛋白是TCE作用下肝细胞中的表达升高的差异蛋白(结合课题组前期研究基础)。研究2:TCE作用下肝细胞中SET相关的mi RNA调控的初步研究方法:通过mi RNA靶基因预测软件和文献查找方法初步筛选出SET相关的多个mi RNAs,然后使用RT-PCR检测这些mi RNAs的表达情况,以表达下调的mi RNAs作为研究对象。构建这些mi RNAs的病毒载体,获取相应病毒上清后转染L-02肝细胞,构建稳定高表达mi RNAs肝细胞并对其高表达效率进行鉴定。结果及结论:利用多种预测软件和文献查找初筛了9个候选mi RNAs,即mi RNA-23a,mi RNA-21,mi RNA-199b,mi RNA-20a,mi RNA-29b,mi RNA-199a,mi RNA-194,mi RNA-221和mi RNA-129。但表达下调的mi RNAs为mi RNA-23a,mi RNA-21,mi RNA-199b,mi RNA-20a。成功构建了其中三个mi RNAs重组病毒载体,转染L-02肝细胞后,这些mi RNAs在转染细胞中的RT-PCR分析显示,与转染空病毒载体的对照组相比,mi R-199b/21/23a等的相对表达量是对照组的1300、3、5倍以上,说明稳定高表达mi R-199b/21/23a肝细胞构建成功。