LncRNA在葡萄膜黑色素瘤中的表达谱与功能研究

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目的:  长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt(核苷酸单位)的功能性RNA分子,无开放阅读框(ORF),不编码蛋白。LncRNA功能广泛,几乎参与了从基因表达到蛋白质翻译等所有方面的细胞生命活动。葡萄膜黑色素瘤是成年人中最常见的一种恶性眼内肿瘤,易发生转移,目前缺乏有效的治疗手段。近年来研究表明lncRNA在肿瘤的发生和发展过程中起着至关重要的作用,然而有关lncRNA在葡萄膜黑色素瘤中的研究仅有少数相关报道,总体上处于空白状态。有鉴于此,本论文旨在探讨lncRNA在葡萄膜黑色素瘤中的表达谱与特定lncRNA的功能,以求更加深入地理解lncRNA在葡萄膜黑色素瘤中的作用。  方法:  (1)利用LncRNA芯片技术检测葡萄膜黑色素瘤中的lncRNA表达谱;  (2)采用生物信息学方法对差异表达的lncRNA进行功能和信号通路分析;  (3)在差异表达的lncRNA中选取lncRNA-5,通过定量PCR技术验证其在葡萄膜黑色素瘤组织标本以及葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达情况;  (4)利用siRNA干扰技术下调lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5中的表达,定量PCR技术检测siRNA的抑制效率;  (5) MTS方法检测lncRNA-5下调对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖能力的影响;  (6)平板克隆形成实验检测lncRNA-5下调对葡萄膜黑色素瘤细胞克隆形成能力的影响;  (7)流式细胞技术检测lncRNA-5下调对葡萄膜黑色素瘤细胞周期的影响;  (8) Transwell迁移实验检测lncRNA-5下调对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移能力的影响;  (9) Western blot法检测lncRNA-5下调对细胞周期相关蛋白的影响;  (10)活体荧光成像技术在体检测lncRNA-5 siRNA对葡萄膜黑色素瘤生长的影响。  结果:  (1) LncRNA芯片实验揭示了5例葡萄膜黑色素瘤组织与正常组织之间的lncRNA差异表达谱,鉴定出显著差异表达的lncRNA(Fold change>2)共1563个,其中肿瘤中显著下调的lncRNA700个,显著上调的863个;  (2)生物信息学分析构建了差异表达的lncRNA以及与细胞生长、增殖和细胞周期等功能相关的lncRNA-信号通路网络;  (3)定量PCR结果显示:与正常葡萄膜黑色素细胞相比,lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达明显升高;同时,与正常组织相比,lncRNA-5在6例葡萄膜黑色素瘤组织中的表达均显著升高(P<0.001);  (4)定量PCR结果显示:lncRNA-5 siRNA能显著抑制 lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达(P<0.001);  (5) MTS增殖实验结果显示:lncRNA-5 siRNA能明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5的增殖(P<0.001);  (6)平板克隆形成实验结果显示:lncRNA-5 siRNA能显著降低葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5的克隆形成能力;  (7)细胞周期检测结果显示:lncRNA-5 siRNA能使葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5在G1期出现明显的滞留现象;  (8) Transwell迁移实验结果显示:lncRNA-5 siRNA能显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5的迁移(P<0.01);  (9) Western blot结果显示:lncRNA-5 siRNA能使葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5中的细胞周期相关蛋白p-Rb、E2F1、Cyclin B1、Cyclin E2、CDK6、CDK2、p-cdc2的表达有不同程度的下调;  (10)活体荧光成像实验结果显示:转染lncRNA-5 siRNA的葡萄膜黑色素瘤细胞在裸鼠眼内的生长明显受到抑制(P<0.05)。  结论:  本研究系统揭示了葡萄膜黑色素瘤中lncRNA的差异表达谱,生物信息学分析构建了lncRNA-信号通路网络。进一步的研究发现lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤组织及细胞中的表达显著上调,功能实验表明在葡萄膜黑色素瘤细胞中下调lncRNA-5的表达可显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖、细胞周期和迁移,并可下调细胞周期相关蛋白p-Rb、E2F1、Cyclin B1、Cyclin E2、CDK6、CDK2、p-cdc2的表达水平。活体荧光成像实验表明下调lncRNA-5的表达可在体抑制葡萄膜黑色素瘤的生长。综上,本研究系统阐明了葡萄膜黑色素瘤中lncRNA的差异表达谱,以及lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤细胞中的生物学功能。研究成果进一步完善了葡萄膜黑色素瘤的分子病理机制,并为该疾病的临床诊断和治疗提供了新的靶点和策略。
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