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以本实验室保存的一株地衣芽孢杆菌MV0658的染色体DNA为模板,设计一对引物,通过PCR方法,获得一段与Bacillus lichenformis ATCC14580中Hydantoin utilization protein B基因相同的特异性扩增主带。分离纯化后,与 pUC19载体通过T4 DNA连接酶平端连接,CaCl2转化法转化大肠杆菌(E. coil)JM109。经α—互补实验筛选出阳性菌落,通过对重组菌株的质粒分离纯化,限制性酶酶切和测序等一系列鉴定实验,得到六个重组质粒,分别命名为 pMV1000—pMV1005,均含有地衣芽孢杆菌Hydantoin utilization proteinB的PCR扩增片段。其中,pMV1000与pMV1001为正向插入,pMV1002、pMV1003、pMV1004为反向插入。我们将重组子pMV1000进行测序,并把克隆到的基因片段命名为海因氧化酶(Hyu_Q)。用测序后的序列在NCBI的GenBank中搜索,采用Blast、ClustalW软件进行核苷酸序列、氨基酸序列分析及同源性比较。结果表明该基因全长1740bp,编码579个氨基酸,G+C含量为51.72%,理论分子量为63KD,理论等电点为5.49,其中疏水性氨基酸占35.8%。
将目的片段从pMV1000中分离出来,与表达载体pET28a连接后转化大肠杆菌Rostta,经过菌落 PCR验证和一系列酶切鉴定实验,表明重组质粒pMV1006中含有PCR扩增片段,且为正向插入。加入IPTG进行诱导表达,得到预期大小的Hyu_Q基因表达蛋白。
将Hyu_Q核苷酸序列与Bacillus lichenformis ATCC14580中Hydantoinutilization protein B核苷酸序列进行同源性比对,发现在Hyu_Q核苷酸序列的1740bp中有8个核苷酸发生改变,其中5个核苷酸发生转换,3个核苷酸发生颠换,两个序列相同性达99%;又将Hyu_Q推测的氨基酸序列与Bacilluslichenformis ATCCl4580中 Hydantoin utilization protein B(YP_079153.1)氨基酸序列进行同源性比对,发现在Hyu_Q推测的氨基酸序列中有6个位置发生了改变,序列相同性达99%。
利用生物信息学软件对Hyu_Q推测的氨基酸进行结构分析及功能预测,结果表明在64-72位,293-299位,339-343位,411-417位氨基酸处有4个较明显的疏水性区域;在第22、76、540和570个氨基酸处有较强的形成α螺旋的倾向,在第55、265、380和468个氨基酸处有较强的形成β折叠片的倾向,有较多随机螺旋结构;Hyu_Q推测的氨基酸序列无N端信号肽,不形成跨膜结构;并对其氨基酸进行了三级结构的预测。