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天然活性物质在工业生产和医药行业有着广泛的应用,微生物作为活性物质的来源,因为繁殖速度快,生产成本低,产量大等优点备受人们关注。本研究主要针对微生物产单宁酶和药用成分石杉碱甲进行探索。包括高效产单宁酶和石杉碱甲微生物菌种的筛选,从发酵液中提取分离活性物质及其产量测定,优化发酵条件。
单宁酶,全称单宁酰基水解酶是一种细胞膜结合酶,它能水解单宁酸的酯键和缩酚酸键产生没食子酸和葡萄糖,用途非常广泛,在酒品,饮料,茶的生产工程中起到调节风味的作用,近年来伴随着茶饮料工业的迅猛发展而得到深入地研究。另外在制革业也有乳化皮革的应作用,是制革的关键步骤。产物中的没食子酸可作为医药中间体,又是食品、化妆品及饲料的抗氧化剂,近年来还用作感光树脂的原料等,已成为市场上需求量较大的一种重要医药、化工原材料。要开展微生物酶法生产单宁酶和没食子酸新工艺的研究,筛选高活性单宁酶产生菌是基础工作.
本研究在紫金山土壤中分离了75株真菌,用含有单宁的筛选培养基筛选出11株产单宁酶的真菌。又经过摇瓶培养,利用紫外分光光度计检测发酵液及菌丝体中的粗酶液的酶活,筛选出一株高效产单宁酶的菌株,经过形态和分子方法鉴定为Aspergillus awamori,测得酶活为18.2 U/ml,产酶最适pH为4.0,培养时间为96h。实验采用不同的碳,氮源对菌株进行发酵培养,发现碳源对产酶有明显的促进作用,氮源表现为抑制作用。水解类单宁及其衍生物对菌株产单宁酶具有促进作用,缩合单宁没有影响,没食子酸具有抑制作用。
石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)是一种倍半萜生物碱,为高效、高选择性、可逆性的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂,具有提高学习记忆力和改善老年人记忆功能的效果,对治疗重症肌无力和早老性痴呆有显著疗效.石杉碱甲制剂(哈伯因),现已应用于临床,用于治疗老年人记忆减退和早期老年性痴呆症.近年研究还证明Hup A有神经保护和预防化学武器的潜力。但是石杉碱甲的构造复杂,人工合成十分困难,且合成产物有副作用,因此石杉碱甲的主要来源还是少数石杉科植物的提取,而该类植物都是古老的蕨类植物,大多已经灭绝,现存植物对生长环境要求苛刻,生产缓慢,可利用野生资源极其有限。开发新的石杉碱甲来源例如产石杉碱甲微生物的筛选是很有意义的。
本研究测定了三种湖南产石杉属植物的石山碱甲产量,采用严格的外植体灭菌方法对蛇足石杉的内生真菌进行分离,并对真菌能否产石杉碱甲作了初步研究,分离得到的9株内生真菌中,来自蛇足石杉茎部的6株,来自叶片的3株。经过高效液相色谱检测,有1株来自茎部的内生真菌产石杉碱甲。