细菌小RNA(small RNAs,简称sRNAs),也叫非编码RNA(non-codingRNA,简称ncRNAs),是细菌中一类一般不编码蛋白质,大小通常介于50-500nt之间,具有独立功能的RNA分子。越来越多的证据表明,除细菌外,小RNA还广泛存在于真核生物和古细菌(Archaea)中,并且在细胞的各种生理过程中发挥着非常重要的作用。研究发现,很多小RNA作为转录后调控因子,通过序列互补的方式与靶标mRNA结合从而抑制或激活靶标mRNA的翻译,或者影响mRNA的稳定性,从而正向或负向调控目标基因的表达,进而影响细菌的各项生命活动。目前,已在很多细菌(包括一些动植物病原细菌)中开展了小RNA的鉴定及功能研究工作,而且许多证据表明,小RNA在动、植物病原微生物的致病过程中发挥了非常重要的作用。但,作为重要的植物病原菌,十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestrispathovar campestris,以下称Xcc)的小RNA的鉴定及功能研究工作目前还未见报道。为了研究小RNA在Xcc中的存在,本研究中,我们采用鸟枪克隆法(shotgun cloning,也称Rnomics),在十字花科黑腐病菌8004菌株(简称Xcc8004)中进行了大规模小RNA筛选和鉴定。首先,我们将Xcc8004在植物诱导培养基XVM2培养至对数生长期(OD600=0.6),然后用热酚法提取总RNA。总RNA经8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离后,割胶回收和纯化大小介于50-500nt的RNA分子[不包括大小约为119nt的5S rRNA]。接着,在纯化的RNA的5和3端分别加上接头,然后,使用3接头特异引物将连接有接头的RNA分子反转录成cDNA,并进一步用3和5接头特异引物进行常规PCR扩增,得到相应的双链cDNA。cDNA纯化后,用Sse83871酶切(Sse83871酶切位点在接头上)并和经.PstI酶切的pUC19载体连接,然后转化E coli JM109感受态细胞并筛选转化子及验证。这样,最后我们得到一个含有大约10,000个独立克隆的50-500nt大小的RNA的cDNA文库。　　 接着,我们从cDNA文库中随机选取约2,500个cDNA克隆进行测序分析,结果得到2,104个cDNA克隆的序列。经过与Xcc8004基因组比对,发现其中1,274个(60.55％)克隆来源于tRNA,444个(21.10％)克隆来源于5SrRNA,67个(3.18％)克隆来源于16S或23S rRNA,257个(12.22％)克隆来源于基因间隔区(IGR),6个(0.29％)克隆来源于编码蛋白的基因的读码框(ORF)内。进一步的分析发现,来源于ORF的序列均对上有关ORF的正义链,说明克隆到的序列来自相应的ORF的mRNA的碎片,因而不是小RNA;来源于基因间隔区序列的257个克隆中256个克隆的序列可以分为6个重叠群,它们和另一个单独的克隆一起,分别来自7个不同的基因间隔区。它们可能分别是7个不同的小RNA基因的转录产物,因此,我们把这6个重叠群序列的克隆和另外一个来源于基因间隔区的单个克隆序列作为候选的小RNA进行Northern杂交验证。Northern杂交验证结果显示,4个杂交主带的大小介于100-200m之间,与对应的重叠群序列的长度吻合,因此证明他们就是小RNA,并分别命名为sRNA-Xcc1、sRNA-Xcc2,sRNA-Xcc3、sRNA-Xcc4。我们进一步通过5-Race和3-Race实验确定了这4个小RNA的基因的精确的转录起始位点和转录终止位点。结果证实,sRNA-Xcc1基因长88bp,位于XC0350和XC0351之间的基因间隔区,其5端距离上游XC0350基因265bp,3端距下游XC0351基因380bp,转录方向与其旁侧基因一样,均为正向转录;sRNA-Xcc2基因长187bp,位于XC0901和XC0902之间的基因间隔区,其5端距离上游XC0902基因96bp,3端距下游XC0901基因280bp,转录方向与其旁侧基因一样,均为反向转录;sRNA-Xcc3基因长110bp,位于XC3244和XC3245之间的基因间隔区,其5端距离上游同样位于此基因间隔区编码Ser tRNA的基因76bp,3端距下游XC3244基因169bp,转录方向与其旁侧基因一样,均为反向转录;sRNA-Xcc4基因长122bp,位于Xcc8004基因组中最长的基因间隔区即XC3924和XC3925之间的基因间隔区,其5端部分序列同样位于此基因间隔区的5S rRNA(XC4382)重叠,3端距下游XC3924基因1228bp。　　 为了弄清这4个小RNA基因在其它细菌的分布,我们首先用这4个小RNA序列比对NCBI小RNA数据库,结果发现它们和数据库中的小RNA没有序列相似性,说明这4个小RNA是全新的小RNA。我们还用这4个小RNA的基因序列BLAST NCBI基因组数据库,发现sRNA-Xcc1的同源序列仅存在于Xcc中,说明它是Xcc特异的小RNA;而其他三个sRNA的同源序列则存在于黄单胞菌属(Xanthomonas)和木质菌属(Xylella)细菌中,而不存在于在其他细菌基因组中。　　 我们使用sRNATarget软件预测了这4个sRNA在Xcc8004基因组可能的靶标,结果显示,很多已知或未知功能的基因包括一些致病基因可能是sRNA-Xcc1、sRNA-Xcc3和sRNA-Xcc4的靶标。sRNA-Xcc1预测的靶标中致病基因包括:与群体感应功能相关的XC2331、XC3163,与胞外分泌功能相关的XC1737,与寄主细胞壁降解功能相关的XC2461、XC3590、XC4197,与脱毒相关的XC1495、XC1495、XC3408、XC4302,与三型分泌系统相关的XC3010,与二型分泌系统相关的XC3571和与其他致病因子相关的XC0797;sRNA-Xcc3预测的靶标中致病基因包括与脂多糖相关的XC3613;sRNA.Xcc4预测的靶标中致病基因包括与胞外分泌相关的XC2211,与三型效应物功能相关的XC0542,与毒素功能相关的XC1859,与脱毒相关的XC2496。预测结果显示只有少数几个基因成为sRNA-Xcc2的潜在靶标。　　 为了研究这些小RNA的功能,我们拟构建他们的缺失突变体并进行表型分析。目前我们已经完成了sRNA-Xcc1和sRNA-Xcc2的缺失突变体DMsRNA-Xcc1和DMsRNA-Xcc2,并对其进行了营养缺陷型、碳源利用、金属离子敏感性、耐盐性、耐渗透压和有机溶剂胁迫、氧化剂和蛋白质变性剂胁迫、生物膜、游动性、胞外多糖、胞外酶、致病力、腿反应等多方面的多种表型分析。分析结果显示,DMsRNA-Xcc1和DMsRNA-Xcc2与野生型菌株Xcc8004相比没有明显的表型差异。说明这两个小RNA可能不参与这些细胞过程或者它们在这些细胞过程不起关键作用。另外两个小RNA的功能还有待进一步研究。　　 综上所述,在本工作中,我们应用鸟枪克隆法在Xcc中进行系统的小RNA鉴定。我们首次在Xcc中鉴定到4个全新的,而且有种属特异性的小RNA。尽管目前没有证据证明这些小RNA参与Xcc的致病过程,但我们的工作为深入研究小RNA在Xcc中的存在和作用,特别是小RNA在Xcc与寄主植物互作中的作用打下了基础。