中华蜜蜂两种嗅觉相关蛋白的基因克隆与功能研究

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蜜蜂复杂且灵敏的嗅觉系统是其识别蜂群内化学信号以及区分外界环境中不同气味物质的生理基础。中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius(简称中蜂)是我国特有的蜜蜂品种,善于利用零星蜜粉源,对我国山区和低温开花的植物授粉有着极其重要的作用,而中蜂的传粉等行为与其嗅觉系统中相关蛋白的功能有着密切的关系。本论文以中蜂为研究材料,利用RT-PCR技术克隆和鉴定中蜂气味结合蛋白AcerOBP11和嗅觉受体AcerOrco两个基因,利用Real-time PCR技术鉴定它们在中蜂不同发育时期及不同组织的表达谱,同时利用大肠杆菌并分离纯化AcerOBP11重组蛋白,体外研究了AcerOBP11的配基结合功能,最后利用荧光免疫组化技术在中蜂采集蜂触角中对AcerOBP11与AcerOrco进行亚细胞共定位。获得的主要结果如下:1.获得了中蜂AcerOBP11基因和AcerOrco基因的全长cDNA序列,其全长分别为427bp和1434bp,GenBank登录号分别为KC818631和JF968610.1。序列分析可知AcerOBP11编码142个氨基酸,含6个保守的半胱氨酸及6个保守的α-螺旋结构,通过氨基酸序列比对及系统进化树分析,AcerOBP11与膜翅目昆虫的信息素结合蛋白PBPs亲缘关系较近,推测AcerOBP11可能是一种PBPs;AcerOrco编码477个氨基酸,含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区,与其他昆虫的Orco有很高的相似性,是一种高度保守的嗅觉受体。2.用Real-time PCR技术鉴定AcerOBP11和AcerOrco在中蜂不同时期及不同组织的表达谱,AcerOBP11和AcerOrco在卵、幼虫和蛹期均呈低丰度表达,AcerOBP11在不同日龄中均只在触角、足和翅中有表达,而在1日龄时主要在触角和翅中表达,在采集蜂时期主要在触角中表达;AcerOrco在1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达,且在1日龄的触角中表达量最高;采集蜂时期的触角、头(去除触角)、胸、腹和翅中均有较高丰度的表达。3.构建pET32-AcerOBP11的原核表达载体并获得AcerOBP11重组蛋白,使用镍琼脂糖凝胶柱分离纯化AcerOBP11重组蛋白。以1-NPN为荧光报告子通过荧光结合实验分析了AcerOBP11重组蛋白与气味物质的结合特性,结果发现AcerOBP11与植物芳香性物质:苯乙醛、3.4-二甲基苯甲醛、4-烯丙基藜芦醚及β-紫罗兰酮等有较强的亲和性,与工蜂信息素法呢醇也有较强的亲和性,表明OBP11可能是一种PBP,参与植物芳香类物质与信息素的识别。4.制备AcerOBP11及AcerOrco多克隆抗体,利用免疫荧光定位技术对AcerOBP11和AcerOrco在采集蜂触角上进行了亚细胞定位,结果显示AcerOBP11只是在触角端节以及各个亚节的连接处有大量分布,而AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达(尤其在触角鞭节端节上表达量较高),而且常成对出现,并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。免疫荧光共定位结果显示AcerOBP11和AcerOrco共同表达于锥形感器(sensilla basiconcum)和板形感器(s. placodeum)中,表明他们在中蜂嗅觉识别过程中共同发挥作用。
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