【摘 要】
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研究目的:肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是一种难治性的原发性肝癌。根治性切除是目前ICC的主要治疗方法,但由于肿瘤的高侵袭性导致手术预后较差。绝大部分患者在疾病诊断时已处于中晚期,失去切除机会的患者主要采用以化疗为主的保守治疗,因此ICC细胞的耐药性严重影响此类患者的生存时间。ICC细胞多呈现对化疗药物的耐药性,但机制尚不清楚。近年来较多研究证
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研究目的:肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是一种难治性的原发性肝癌。根治性切除是目前ICC的主要治疗方法,但由于肿瘤的高侵袭性导致手术预后较差。绝大部分患者在疾病诊断时已处于中晚期,失去切除机会的患者主要采用以化疗为主的保守治疗,因此ICC细胞的耐药性严重影响此类患者的生存时间。ICC细胞多呈现对化疗药物的耐药性,但机制尚不清楚。近年来较多研究证实肿瘤微环境在肿瘤发生发展和耐药方面起着重要作用。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）作为肿瘤微环境的重要组成部分,在ICC的生物学特性起着怎样的作用尚不清楚。本课题旨在探讨肿瘤微环境中MSCs对ICC细胞耐药性的影响及其潜在机制。研究方法:1、通过流式细胞技术分选ICC组织中的MSCs和正常人骨髓源性的MSCs分别作为实验组和对照组,以SSEA-4抗原作为筛选标记,获得MSCs-SSEV4阳性细胞。对分选出的MSCs进行实时定量PCR（real-time PCR）和蛋白质印迹（western blot,WB）检测,确定两组细胞中疱疹病毒侵入介质（herpes virus entry mediator,HVEM）的表达情况。2、构建高表达HVEM的MSCs作为实验组,正常MSCs作为对照组,分别与ICC细胞株共培养,在培养48h时后加入化疗药物,用CCK8实验及实时凋亡检测试剂盒对ICC细胞增殖及凋亡进行检测。3、用Bio-Plex法检测两组MSCs中细胞因子的表达情况,对比筛选出可能诱导MSCs高表达HVEM的炎症因子。取该因子处理ICC细胞作为实验组,空白处理ICC细胞作为对照组,在培养48h时后加入化疗药物,用CCK8实验及实时凋亡检测试剂盒对ICC细胞增殖及凋亡进行检测。4、用WB方法检测在被筛选出的炎症因子处理下,ICC细胞的自噬水平。采用CCK8实验和细胞凋亡试验检测化疗药物对关键炎症因子处理后的ICC细胞的影响。5、通过WB方法确定AMPK/m TOR信号通路在被筛选出的炎症因子诱导ICC细胞化疗抵抗中的作用。6、收集80名ICC患者的临床病理及随访资料,通过免疫组化评分根据上述炎症因子表达水平高低,将患者分为两组。通过免疫组化法检测自噬相关标记物表达,分析该炎症因子与自噬相关标记物表达水平的相关性。应用KaplanMeier生存分析比较两组患者的远期预后。结果:1、HVEM高表达于从ICC微环境中分选出的MSCs;2、高表达HVEM的MSCs促进ICC细胞的化疗抵抗能力;3、高表达HVEM的MSCs通过分泌白细胞介素-6（interleukin 6,IL-6）促进ICC细胞的化疗抵抗能力;4、IL-6通过激活自噬促进ICC细胞的化疗抵抗能力;5、IL-6通过上调AMPK/m TOR信号通路激活自噬;6、IL-6的表达水平与ICC细胞自噬水平及ICC患者较差的临床预后具有相关性。结论:本研究结果表明ICC中的MSCs可以过量表达HVEM,分泌高水平的IL-6。通过IL-6诱导AMPK/m TOR信号通路激活自噬,进而维持ICC细胞的存活和促进化疗抵抗能力。本研究从肿瘤微环境角度阐明MSCs对ICC化疗抵抗的影响及其作用机制,HVEM表达水平和IL-6表达水平有望为判断ICC的预后提供新的指标,相关通路的发现可能为ICC治疗提供新的靶点。
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