随着进入市场的手性药物种类的急剧增长,手性药物及其中间体的制备备受关注。药物氯吡格雷是一种血小板凝集抑制剂,用于治疗心血管疾病,2009年其销售额全球排名第二。R-邻氯扁桃酸甲酯是氯吡格雷制备中的重要中间体,目前已有多种合成途径。但这些方法存在使用剧毒HCN或昂贵NADP+,产率低等缺点。本研究以外消旋邻氯扁桃酸甲酯为底物,以扁桃酸消旋酶和酯酶BioH分别作为外消旋反应和水解反应的催化剂,构建双酶偶联动态动力学拆分法制备R-邻氯扁桃酸甲酯,开发了一种环境友好、低成本、高产率的合成策略。首先,为了深入了解影响酶对映体选择性的因素,以脂肪酶CALB为对象,采用QSAR分析建立了对映体选择性(E值)定量预测模型。结果表明CALB对映体选择性受多种分子作用(立体作用、疏水作用、静电作用、氢键作用)的影响。基于以上4种相关分子场建立的模型的预测精度Rpred为0.92。此外,对分子场等势图的分析表明影响CALB选择性的氨基酸除了活性中心的催化氨基酸,还广泛分布在酰基、醇基结合口袋和底物进出通道。接着,采用基于结构信息的理性设计,定制了对S-邻氯扁桃酸甲酯具有高对映体选择性的酯酶BioH。借助于分子动力学模拟技术,基于对映体在酶活性中心的结合构象差异,微调酶-底物过渡态之间的空间位阻及电子作用,成功将酯酶BioH的选择性(E值)从3.3(野生型)提高至73.4(L123V/L181A/L207F),为后续的动态动力学拆分奠定了基础。随后,将重心转至扁桃酸消旋酶的改造。通过分子模拟和MM-PBSA结合能分析发现残基S139通过氢键稳定酶-底物复合物,且S139和E317对底物稳定具有协同作用。将S139突变成Ala不仅会破坏S139与底物之间的氢键,还会影响活性中心其他氨基酸与底物的相互作用,导致消旋酶对R-扁桃酸和S-扁桃酸的催化速率的下降(分别下降了45倍和60倍)。该研究加深了对消旋酶催化机制的理解,对消旋酶的改造具有指导意义。进而,以酶-底物过渡态结合能为标准,采用酶计算设计策略对消旋酶进行改造,提高了其对非天然底物的催化活性。突变体对R-间氯扁桃酸、R-2-萘乙醇酸、R-扁桃酰胺和R-邻氯扁桃酸的催化效率(Kcat/Km)分别为1.3×106、1.7×104、8.5×104、2.1×103M-1s-1,与野生型相比提高了2-5倍,证明该设计策略是一种有效的酶改造手段。最后,将改造后的扁桃酸消旋酶和酯酶BioH用于动态动力学拆分制备R-邻氯扁桃酸甲酯。研究表明水解体系中消旋酶的加入不仅加快了S-邻氯扁桃酸甲酯的水解速率,还提高了酯酶BioH对S-领氯扁桃酸甲酯的表观E值。在pH7.7,25℃,酯酶/消旋酶的摩尔比为1：21,底物初始浓度25mM(500μl体系)的拆分条件下,经4次循环拆分后,产物R-邻氯扁桃酸甲酯的收率为80%,ee值大于97%。