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目的:百草枯（Paraquat,PQ）,化学名称为1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶阳离子盐,是一种高效除草剂。由于PQ除草效果好且在土壤中能快速降解,因而在农业生产中被广泛应用。然而,PQ对人类和啮齿动物有很强的毒性,即使是极少量的摄入也可能导致致命的后果。自20世纪60年代首次报道了PQ中毒致人死亡的病例后,在世界各地特别是在发展中国家,因服用或者意外接触PQ导致中毒的病例常有出现。由于PQ中毒机制研究尚未完全阐明,且缺乏特效解毒剂,导致其中毒患者病死率居高不下,所以PQ中毒治疗已经成为一个棘手的医学问题。PQ中毒的主要靶器官是肺脏,急性肺损伤和肺间质纤维化是中毒患者的主要死因。目前研究已经表明,肺泡上皮细胞损伤在PQ致肺脏损伤中具有重要作用。因此,进一步揭示PQ诱导肺泡上皮细胞损伤的分子机制将有助于PQ中毒机制的阐明,为其治疗提供理论基础以及可能的治疗靶点。微小RNAs（microRNAs,miRNAs）是一类序列高度保守的长度约为18至24个核苷酸的非编码RNA,通过与3’非翻译区（3’-UTR）的结合从而调节细胞增殖分化、信号转导、凋亡、肿瘤发生发展等生理和病理活动。近年来,miRNAs在多种生物学和病理过程中转录后调控基因表达,已成为生物医学研究的一个重要领域。PQ可以通过多种机制诱导肺泡上皮细胞损伤,如:氧化应激导致的脂质过氧化、蛋白质交联失活、线粒体和染色体损伤以及急性炎症反应的激活、肺微血管屏障的破坏等。在这一损伤进程中,miRNAs作为基因表达的调节因子很可能发生了改变,并发挥了促进或者抑制损伤的作用。虽然目前已经有了一些关于miRNAs与PQ中毒相关联的报道,但尚无PQ致肺上皮细胞损伤过程中的miRNA表达谱的研究,而这些miRNAs的调控机制也仍待阐明。在本研究中我们选用小鼠肺泡上皮细胞样细胞MLE-12作为研究PQ诱导肺损伤的体外模型,观察PQ对其损伤的相关指标并检测miRNA表达谱的改变情况。并进一步探讨差异表达的miRNAs可能调节的基因以及相关信号通路与肺泡上皮细胞损伤之间的联系。研究方法:1、PQ诱导MLE-12细胞损伤模型的细胞活力检测:（1）MLE-12细胞培养并分组处理;（2）CCK-8法检测细胞活性。2、PQ诱导MLE-12细胞损伤模型的细胞凋亡率检测:（1）MLE-12细胞培养并分组处理;（2）Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。3、PQ诱导MLE-12细胞损伤24h时miRNA表达谱基因芯片检测及差异表达的miRNAs的验证:（1）MLE-12细胞培养并分组处理;（2）用TRIZOL法提取细胞总RNA;（3）使用Agilent Mouse miRNA（8*60K）V21.0检测miRNAs;（4）安捷伦扫描控制软件进行扫描,采用安捷伦特征提取软件V10.7.1.1进行数据提取;（5）MLE-12细胞培养并分组处理;（6）用TRIZOL法提取细胞总RNA;（7）茎环法逆转录差异表达的miRNAs,荧光定量PCR检测miRNAs的表达量。4、差异表达的miRNAs的靶基因预测以及靶基因结果的统计分析:（1）使用在线分析平台mi RDB、Target Scan对差异表达的miRNAs的靶基因预测;（2）使用GO数据库及KEGG数据库对靶基因进行功能富集分析;（3）使用Cytoscape 3.61构建miRNAs-m RNA网络,并分析它们之间的联系。结果:1、PQ诱导的MLE-12细胞损伤使细胞活力降低:（1）PQ对MLE-12细胞表现出明显的细胞毒性,使细胞活力呈浓度依赖性降低;（2）在处理时间为24h、PQ浓度为100μM时,细胞活力大概降低至原有的一半。2、PQ诱导了MLE-12细胞的凋亡:PQ可以诱导MLE-12细胞凋亡,且细胞凋亡率呈PQ浓度依赖性升高。3、PQ诱导MLE-12细胞损伤时miRNA表达谱发生改变以及验证:（1）在PQ诱导MLE-12细胞损伤时,以下miRNAs呈明显下调趋势:mmu-mi R-106b-5p、mmu-mi R-125a-5p、mmu-mi R-130a-3p、mmu-mi R-19b-3p、mmu-mi R-23a-3p、mmu-mi R-23b-3p、mmu-mi R-24-3p、mmu-mi R-25-3p、mmu-mi R-26a-5p、mmu-mi R-29a-3p;mmu-mi R-1892呈明显上调趋势;（2）选择差异表达最为显著的以下miRNAs:mmu-mi R-106b-5p、mmu-mi R-125a-5p、mmu-mi R-130a-3p、mmu-mi R-19b-3p、mmu-mi R-23b-3p、mmu-mi R-29a-3p,使用荧光定量PCR进行验证,实验结果符合基因芯片的检测结果。4、差异表达的miRNAs的靶基因预测以及靶基因结果的统计分析:共有4183个基因可能是这些差异表达miRNAs的靶基因,其中633个基因可被多种miRNAs共同调节。（1）GO分析结果表明,差异表达的miRNAs主要影响细胞的线粒体凋亡途径（线粒体膜蛋白插入与凋亡信号传导的正调控、渗透胁迫对内源性凋亡信号传导的正调控）以及DNA的甲基化（5-甲基胞嘧啶的合成和分解代谢过程）等细胞凋亡相关进程;（2）KEGG通路分析结果表明,差异表达的miRNAs的靶基因与PI3K-Akt信号通路、m TOR信号通路、RAS信号通路、TNF信号通路关系密切。结论:1、PQ诱导MLE-12细胞损伤时,细胞活力呈PQ浓度依赖式降低,细胞凋亡率呈浓度依赖式升高。2、PQ诱导MLE-12细胞损伤时,miRNA表达谱发生改变,共有10种miRNAs明显下调,1种miRNA明显上调。荧光定量PCR结果验证了基因芯片的准确性。3、miRNAs靶基因预测以及结果富集分析提示,这些差异表达的miRNAs可能与线粒体凋亡途径与DNA的甲基化进程密切相关。