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背景:脆性X综合征(Fragile X Syndrome,FXS),是最常见的一种遗传性认知障碍疾病,也是一种与自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorders,ASDs)相关的疾病,主要是由于脆性X智力低下基因(Fragile X Mental Retardation 1,FMR1)的异常扩增和甲基化导致脆性X智力低下蛋白(Fragile X mental retardation protein,FMRP)缺乏引起的。FMRP是RNA结合蛋白,在生物化学和遗传学上均与miRNA调控通路有联系。脆性X相关基因1(Fragile X related gene 1,FXR1)是FMR1的同源基因,其编码的脆性X相关蛋白1(Fragile X related protein 1,FXR1P)在氨基酸序列上与FMRP高度同源、功能相似,共同构成了脆性X蛋白家族。hsa-miR-19b-3p是本课题组前期研究发现的与FXR1相关的miRNA,与hsa-miR-19a-3p属于同一个miRNA家族,但FXR1与二者之间的调控机制并不清楚。因此,本文的研究旨在阐明FXR1参与的miRNA调控网络,揭示其在FXS中的作用及分子机制。目的:研究FXR1与hsa-miR-19a/b-3p、hsa-miR-19a/b-3p与靶基因以及FXR1与靶基因之间的调控关系,以期发现FXR1---hsa-miR-19a/b-3p---靶基因三者之间的调控网络;同时,研究hsa-miR-19a/b-3p及FXR1对SH-SY5Y细胞生长的影响。方法:(1)利用TargetScan、miRWalk、miRanda等十个数据库和STRING、GeneCards、NCBI等在线服务器预测并分析hsa-miR-19a/b-3p的靶基因及其功能;(2)采用QRT-PCR技术检测在SH-SY5Y细胞中hsa-miR-19a/b-3p和FXR1对其靶基因的转录调控作用;(3)Western blot技术检测hsa-miR-19a/b-3p和FXR1对其靶基因的翻译调控作用;(4)MTT法检测hsa-miR-19a/b-3p及FXR1对SH-SY5Y细胞增殖活力的影响;(5)流式细胞术和Hoechst33342染色法检测hsa-miR-19a/b-3p及FXR1对SH-SY5Y细胞凋亡和周期的影响;(6)构建含有Dusp6的红色荧光蛋白载体pDsRed2-N1-Dusp6,利用荧光显微镜检测DUSP6和FXR1P在细胞内的表达及定位。结果:一、hsa-miR-19a/b-3p在SH-SY5Y细胞中的生物学功能研究:(1)利用生物信息学技术筛选到hsa-miR-19a/b-3p的七个候选靶基因为FXR1、RAB18、USP32、CD47、Cdkn1a、Rhob和Dusp6;(2)QRT-PCR结果显示:hsa-miR-19a/b-3p过表达后,FXR1、Dusp6、Rhob的mRNA水平均下降(P<0.05),RAB18、USP32的mRNA水平均上升(P<0.01),CD47和Cdkn1a的mRNA水平均无明显改变(P>0.05);(3)Western blot结果显示:hsa-miR-19a/b-3p过表达后,FXR1、Dusp6和Rhob的蛋白水平均下降(P<0.01),RAB18和USP32的蛋白水平均上升(P<0.05),而CD47和Cdkn1a的蛋白水平没有明显改变(P>0.05);(4)MTT结果显示:SH-SY5Y细胞分别转染hsa-miR-19a/b-3p mimics后,细胞增殖均被抑制(P<0.05);分别转染hsa-miR-19a/b-3p inhibitor mimics后,细胞增殖均被促进(P<0.05);(5)细胞凋亡检测结果显示:相对于miRNA NC mimics对照组,SH-SY5Y细胞分别转染hsa-miR-19a/b-3p mimics后均促进细胞凋亡;相对于miRNA inhibitor NC mimics对照组,转染hsa-miR-19a/b-3p inhibitor mimics后均抑制细胞凋亡;(6)细胞周期检测结果显示:相对于miRNA NC mimics对照组,SH-SY5Y细胞分别转染hsa-miR-19a/b-3p mimics后,处于G1期的细胞分别增加6.92%和3.98%,S期细胞分别减少4.02%和2.28%,G2期细胞分别减少2.90%和1.71%;相对于miRNA inhibitor NC mimics对照组,分别转染hsa-miR-19a/b-3p inhibitor mimics后,处于G1期的细胞分别减少2.58%和2.68%,S期细胞分别增加5.11%和3.78%,G2期细胞分别增加2.54%和2.27%。二、FXR1在SH-SY5Y细胞中的生物学功能研究:(1)QRT-PCR结果显示:FXR1过表达后细胞中hsa-miR-19a/b-3p表达水平均上升(P<0.05),USP32的mRNA水平上升(P<0.01),Cdkn1a、Dusp6、Rhob的mRNA水平均下降(P<0.05),而RAB18的mRNA水平没有明显改变(P>0.05);(2)Western blot结果显示:FXR1过表达后,USP32的蛋白水平上升(P<0.01),Cdkn1a、Dusp6的蛋白水平均下降(P<0.05);(3)MTT结果显示:FXR1过表达后能够抑制SH-SY5Y细胞增殖;(4)细胞凋亡检测结果显示:FXR1过表达能促进SH-SY5Y细胞凋亡;(5)细胞周期检测结果显示:FXR1过表达后,处于G1期的细胞减少9.0%,S期增加14.57%,G2期减少13.83%。三、FXR1P与DUSP6的相互作用研究:(1)通过PCR扩增获得大小约为1.1Kb的Dusp6产物,将其克隆至pDsRed2-N1空载体中,经双酶酶切、测序和Blast分析后显示DNA序列正确;(2)SH-SY5Y细胞中分别单转和共转pEGFP-N1-FXR1和pDsRed2-N1-Dusp6后,荧光显微镜观察显示:胞浆中分别可见绿色和红色荧光,说明FXR1P和DUSP6均定位在胞浆;共转两种重组载体后,结果显示:FXR1P和DUSP6均可在胞浆的相同位置表达,在胞浆处存在共定位现象。结论:(1)FXR1与hsa-miR-19a/b-3p相互调控,FXR1、RAB18、USP32、Dusp6和Rhob是hsa-miR-19a/b-3p的靶基因;USP32、Dusp6、Rhob及Cdkn1a是FXR1的靶标;(2)FXR1与hsa-miR-19a/b-3p过表达后均能抑制SH-SY5Y细胞增殖,促进其凋亡,影响细胞周期进程;(3)成功构建了重组载体pDsRed2-N1-Dusp6,FXR1P与DUSP6共定位在SH-SY5Y细胞的胞浆。