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N-糖链不管是在哺乳动物还是植物中都具有重要的生物学功能,而不同的糖链结构对其生物学功能也存在不同影响。为了研究N-糖链结构与功能的关系,首先需要将N-糖链从所连接的糖缀合物上释放下来。N-糖酰胺酶(PNGase)可以将N-糖链从糖蛋白或糖肽上酶解释放,并最大程度的保持糖链结构及蛋白的完整性,因此是研究蛋白质N-糖基化的关键酶。目前商业化生产的N-糖酰胺酶包括PNGase A和PNGase F,但两者在很多方面都存在一定的局限性,如PNGase F不能酶解释放含有核心α1,3修饰的N-糖链,PNGase A只能作用于消化后的糖肽等。新开发的两种N-糖酰胺酶PNGase FⅡ和PNGase H+在使用中也存在着酶活性不高或反应所需pH条件较酸等问题,因此开发新的具有更强大功能的N-糖酰胺酶对推动N-糖基化的深入研究具有重要意义。此外,了解不同类型N-糖酰胺酶的结构及差异,是探究其不同生物学功能及反应机理的基础。目前对于N-糖酰胺酶蛋白结构的研究主要集中在PNGase F类和胞质PNGase,而对于PNGase A类N-糖酰胺酶的蛋白结构研究仍属于空白领域。因此对于该类N-糖酰胺酶蛋白结构的解析有助于更好地了解N-糖酰胺酶结构与功能的关系。本论文从Dyella japonica中找到了可能具有N-糖酰胺酶活性的基因,命名为PNGase Dj,将该基因在原核系统中进行重组表达,验证了其功能并测定了酶学特性。利用多重序列比对和定点突变技术,找到了影响酶活性的关键氨基酸。通过对蛋白晶体结构的解析,发现了该酶的底物结合及催化位点。将PNGase Dj应用于实际样品中,了解了其在多种类型N-糖链共同存在时的优先选择性。具体研究内容和结果如下:1.PNGase Dj的基因合成、重组表达、纯化及酶学特性测定从Dyella japonica基因组中找出目标基因序列进行基因合成。将合成后的基因转入大肠杆菌中进行重组表达并对表达所使用的感受态细胞、表达温度和时间进行优化,最终选取BL21感受态细胞在15℃条件下进行过夜表达。表达后的产物经过纯化得到了单一条带,经过MALDI-TOF-MS验证为目的蛋白。酶学特性研究表明PNGase Dj的最适反应pH为4.0,最适反应温度为37℃,酶促反应不需金属离子作为辅因子,热稳定性测试结果说明该酶不是耐热酶,但加入终浓度为0.5%的BSA可大大提高该酶的稳定性。底物特异性研究显示PNGase Dj可以直接作用于不变性及经过热变性处理的糖蛋白,酶解释放所有类型的N-糖链包括来源于昆虫及植物中含有核心α1,3岩藻糖的结构。因此PNGase Dj是一种综合了 PNGase A和PNGase F两者优点的新酶。2.PNGase Dj酶的活性位点研究研究发现天冬氨酸和谷氨酸是影响PNGase F酶活性的关键氨基酸。因此选取具有相同功能的四种同源N-糖酰胺酶基因序列进行比对,共找出13种含有天冬氨酸或谷氨酸的保守位点。分别对其进行定点突变,通过比较13种突变体与野生型PNGase Dj的相对酶活力,发现对位于第101位的天冬氨酸和第235位的谷氨酸进行突变后,其相对酶活性仅为野生型的2.2%和1.3%,因此判断Asp101和Glu235是影响PNGase Dj酶催化活力的关键氨基酸。对这两个位点与底物的结合能力进行研究发现,这两个位点的突变不会影响酶与底物的结合能力。对酶与底物分离条件的初步筛选显示0.1 M醋酸可实现酶与底物的分离,因此该突变体的获得可以为糖蛋白富集纯化方法的建立奠定基础。3.PNGase Dj酶的蛋白结晶条件筛选及晶体结构解析通过对PNGase Dj纯化条件的进一步优化,得到了纯度较高的蛋白溶液并在0.1 M磷酸/柠檬酸缓冲液pH 4.2,沉淀剂为40%(v/v)乙醇及5%(w/V)PEG1000的条件下获得了蛋白晶体。通过改变沉淀剂种类、比例及结晶方式在初筛条件的基础上进行优化,最终在0.1 M磷酸/柠檬酸缓冲液pH 4.2,沉淀剂为40%(v/v)乙醇及5%(w/v)PEG1500的条件下获得了优化后的蛋白晶体,利用该条件结合种晶接种方法将野生型与突变型PNGase Dj与底物进行共结晶,获得了相应晶体。经X光衍射蛋白及复合物晶体分辨率均为1.08 A,空间群为P1。利用硒代甲硫氨酸衍生蛋白在原始PNGase Dj蛋白晶体生长条件下进行种晶接种,获得了硒代蛋白衍射晶体,成功解决了 PNGase Dj晶体的相位缺失问题,解析出了 PNGase Dj的蛋白结构,以该结构为模板解析出突变体与底物复合物的结构。确定了 Asp101和Glu235为PNGase Dj的催化位点。4.PNGase Dj酶的应用以人乳及萝卜中提取的蛋白质作为底物,检测PNGase Dj对于哺乳动物及植物来源N-糖链的酶解释放能力,并使用MALDI-TOF-MS/MS对酶解释放的N-糖链结构进行解析。通过比较PNGase Dj与PNGase F和PNGase H+对于相同底物酶解后所得图谱的差异,发现在其它类型N-糖链存在的前提下,PNGase Dj会优先酶解释放不含有高甘露糖型结构的N-糖链。此外,相比于其它两种N-糖酰胺酶,PNGase Dj对于含有核心α1,3岩藻糖修饰的N-糖链酶解效率最高。通过对萝卜中释放下来的N-糖链结构进行解析,共发现14种结构,包含高甘露糖型、杂合型及复杂型。其中5种结构为高甘露糖型结构,8种结构含有木糖修饰,3种结构既存在核心α1,3岩藻糖修饰又存在木糖修饰,6种结构在糖链末端存在1-2个N-乙酰氨基葡萄糖。