结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病,以肺结核最为常见。近年来,多耐药和广泛耐药结核菌的出现已经加剧了结核病的流行。这与结核分枝杆菌独特的细胞壁组成可能有直接的关系,结核分枝杆菌细胞壁中含有丰富的脂类,主要成分是分枝菌酸。在进行潜伏感染时,结核分枝杆菌主要是进行脂质代谢而非碳水化合物代谢。为了能在胞内生存,结核分枝杆菌感染巨噬细胞后,积累的脂质会以三酰甘油（TAG）的形式储存,为生长提供能源。在结核分枝杆菌的基因组中,有大约250个基因参与脂类代谢,这250个基因可以分为5个家族:Lip家族、磷脂酶家族、PE/PPE家族、β-内酰胺家族和角质酶家族。本文主要围绕结核分枝杆菌Lip家族成员—LipW（Rv0217c）进行相关功能研究。本课题主要研究结核分枝杆菌Lip家族成员之一—LipW（Rv0217c）,探究LipW蛋白在结核分枝杆菌中的生物学作用;LipW的缺失菌株抵抗胁迫环境（SDS、酸和H₂O₂等）的能力;LipW是否会对巨噬细胞产生免疫反应,可否作为新型的结核保护疫苗。利用以下试验方法去探究LipW蛋白的性质,（1）通过NCBI数据库和ESPript 3.0（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）对Lip家族成员及LipW在其他分枝杆菌中的同源基因编码的氨基酸序列进行比对,确定LipW亚家族和其基因环境稳定性;（2）通过基因克隆技术,将pET-28a-Rv0217c的重组质粒转到大肠杆菌BL21中,在37℃下以包涵体形式表达,并纯化了蛋白LipW,经过复性得到了纯度较高的LipW蛋白,并测定该蛋白的最适底物,最佳温度以及最适pH,包括动力学参数等;（3）将预测的3个活性位点进行点突变(Ser¹⁴⁹,Asp²³⁹,His²⁶⁹),并将三个点突变的蛋白进行纯化然后复性,测定蛋白活性变化;（4）在耻垢分枝杆菌中通过同源重组的方法构建了LipW缺失菌株（ΔMSMEG₀280）,并构建其回补菌株（ΔMSMEG₀280::Rv0217c）,而后,通过纸片法测定敲除菌株对表面压力SDS和氧化压力H₂O₂的耐受情况;模拟结核分枝杆菌侵染巨噬细胞之后,在可能会面对的胞内环境（酸和低氧等）中,敲除菌株的生长情况;（5）通过实验发现LipW蛋白定位在耻垢分枝杆菌的细胞壁上,所以我们猜测LipW可能作为抗原参与毒力作用。将LipW蛋白过表达于耻垢分枝杆菌中,经过诱导后,用过表达菌株去侵染THP-1巨噬细胞,探究其随着时间的推移,胞内菌量与细胞因子的转录水平的变化。我们得到如下结果:（1）成功构建重组质粒pET-28a-Rv0217c,以及三个突变质粒（S149A、D239A、H269A）;（2）蛋白实验结果表明pNP-C₂作为该蛋白的最适底物,表面抑制剂SDS、PMSF以及吐温80等都会影响LipW蛋白的活性,第149位丝氨酸突变和第269位组氨酸突变后该蛋白大部分活性丧失;（3）与野生型菌株相比,敲除菌株对SDS、H₂O₂、酸以及低氧压力环境更为敏感,回补菌株中可以回补其野生菌株的表型;（4）与空载菌相比,侵染巨噬细胞之后的48 h内,过表达菌株的存活能力更强;而且其细胞因子IL-6和IL-12等都显著上调,表明LipW可能作为一种抗原参与宿主免疫应答。综上所述,LipW蛋白偏好于水解短链碳;而且受到表面压力SDS、氧化压力H₂O₂、低氧应激和酸的影响,这说明LipW可以直接参与胞内的胁迫应答。用LipW蛋白去刺激巨噬细胞,能够促进细胞因子的释放,发挥免疫保护作用。所以,我们认为LipW能够作为一种催化剂催化胞内不饱和脂肪酸的水解,为细菌生长提供能量物质。此外,LipW可能具有免疫原性,为新药开发提供理论向导。