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由猪伪狂犬病毒导致的伪狂犬病是造成公猪、母猪繁殖障碍以及仔猪神经症状的一种烈性传染病。长链非编码RNA（lnc RNA）是一类200bp以上不具有编码蛋白质能力的RNA。大量研究表明疱疹病毒能编码lnc RNA并在调节病毒毒力及功能方面具有非常重要的作用,但一些PRV编码lnc RNA的作用机制尚未阐述。本课题通过3’RACE和5’RACE实验了解到PRV Ea株长链非编码RNA CTO-S全长为267bp,并通过Western blot验证其不具有编码多肽的能力。利用细菌人工染色体技术（BAC）构建CTO-S全长缺失重组病毒研究其生物学特性,发现CTO-S对PRV在PK-15中的增殖以及横向扩散无显著影响。在此基础上进一步研究CTO-S的作用机制及相关功能,应用lnc RNA pull down联用质谱技术以及RNA免疫沉淀技术进行验证,发现CTO-S与Cytochrome b-c1 complex subunit 1、RNA binding protein相互作用。下一步期望从病毒与宿主相互作用入手,研究PRV的潜伏感染机制,为PRV的潜伏感染以及新型疫苗研发提供理论基础和新的思路。本课题具体研究如下:1. PRV Ea CTO-S序列的确定要对CTO-S的功能进行研究必须先了解其特性,因此,本节首先对CTO-S的全长序列进行分析实验,提取感染PRV Ea的PK-15细胞总RNA,反转录得到c DNA之后,进行全长扩增,CTO-S的5’及3’端采用SMARTer RACE kit获得。结果表明PRV Ea株CTO-S全长为267bp。2. PRV Ea CTO-S发育进化树分析以及编码多肽能力验证通过BLAST多株Gen Bank已经公布的CTO-S序列进行发育进化树分析,结果表明CTO-S保守性高。而且,通过生物信息学分析,预测到CTO-S具有3个可能编码多肽的开放阅读框。通过将这3个开放阅读框克隆至pc DNA3.1载体,转染至HEK-293T细胞,发现此3个开放阅读框均不能编码多肽,进一步验证了CTO-S不具备编码多肽的能力。3. PRV Ea CTO-S转录时序为了进一步研究CTO-S在PRV感染情况下的表达情况,本研究检测了PRV Ea株感染PK-15细胞不同时间点CTO-S的转录水平。结果表明在MOI=1的感染下接种PRV到PK-15细胞中,前3 h检测不到CTO-S的表达,后续随着时间的延长,CTO-S的表达量逐渐增高。4. PRV Ea CTO-S功能研究根据CTO-S表达情况,本研究利用实验室PRV-BAC技术,成功构建了CTO-S缺失的PRV重组病毒和回复突变重组病毒。在PK-15上皮细胞中的一步和多步生长曲线表明PRV重组病毒与野生PRV及回复突变株这三种毒株具有相似的复制能力,均在感染24 h后达到平台期,病毒滴度达到(108.43PFU/m L、108.86PFU/m L、108.50PFU/m L),结果表明缺失CTO-S对病毒增殖没有影响。空斑实验表明缺失CTO-S重组毒在PK-15细胞上导致空斑形态无明显差异。以上结果表明CTO-S对病毒复制没有很大关联。于此,为了更深入了解CTO-S和宿主之间的相互作用,本研究利用RNA pull down技术以及质谱分析,筛选到实验组有232个蛋白,对照组有138个蛋白,实验组和对照组共用675个蛋白。这些蛋白潜在与CTO-S相互作用。我们挑选了总肽段覆盖率高的2个蛋白（Cytochrome b-c1 complex subunit 1,RNA binding protein）进行后期验证。最后利用RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）方法验证出该蛋白与CTO-S相互作用。