骨骼肌组织中的成肌细胞是以肌卫星细胞的形式而存在,是肌肉组织的前体细胞,在骨骼肌的生长、发育、损伤及移植中具有重要作用。研究如何有效控制肌卫星细胞的分化,使骨骼肌朝着良性发展具有很重要的实践意义。Wnt蛋白是一种由Wnt基因编码的分泌型蛋白,通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合,激活细胞内信号通路,调节靶基因的表达,调控胚胎的早期发育,而且与细胞极性建立、细胞命运决定等多个发育事件有关。此外,它在高等动物的胚胎发育过程中主要参与细胞的增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等。Wnt信号在胚胎发生中肌肉形成过程中是必要的,是肌细胞终末分化和卫星细胞定向的关键调控因子。Wnt10b能特异性的调控肌细胞和再生肌肉的生脂潜能,并且激活Wnt10b可以抑制脂肪细胞分化。本试验以初生健康长白仔猪为试验动物,采用RT-PCR技术成功克隆猪Wnt10b基因与Wnt/β-catenin信号通路关键因子TCF4;分离培养骨骼肌肌卫星细胞,Wnt/β-catenin信号通路激活剂25mM LiCl处理,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色、HE染色、半定量RT-PCR和Western Blot等方法,研究Wnt/β-catenin信号通路对肌卫星细胞增殖分化的影响,并对其机理进行初步探讨。主要获得以下研究结果:1.克隆了猪Wnt10b基因部分CDS序列1190bp,包含起始密码子ATG。向GenBank提交,获得登录号EU181371,并对其进行生物信息学分析,发现与GenBank上已公布的人、小鼠、大鼠、牛、马和黑猩猩核苷酸的同源性分别为94%、89%、89%、92%、93%和92%;氨基酸同源性分别为98%、96%、96%、94%、98%和97%。表明该基因在不同物种间具有很高的保守性。该段基因编码394个氨基酸,具有Wnt家族保守的WNT1功能结构域和糖基化位点。2. RT-PCR检测Wnt10b在猪不同组织中的表达差异,结果表明该基因在猪肝脏中表达量最高,心脏、肌肉组织、皮下脂肪以及脾脏中也表达。3.成功克隆Wnt/β-catenin通路关键因子TCF4基因全长CDS序列2015bp,提交GenBank获得登录号EU694100。与GenBank上已公布的人、小鼠、大鼠、猕猴、牛和马的TCF4基因进行比对,同源性依次为94 %、90%、89%、93%、93%和95%。生物信息学分析发现开放式阅读框位于1-1281位。4. 25mM Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl处理猪骨胳肌细胞,发现能促进骨骼肌细胞的成肌分化,而且发现随着成肌分化的进行,β-catenin蛋白的表达量逐渐上升。