论文部分内容阅读
鞘脂是真核生物细胞膜结构的重要组分，△8-不饱和鞘脂与植物的抗性生理密切相关，而△8-鞘脂脱氢酶是催化鞘脂长链基C8位脱氢生成△8-不饱和鞘脂的关键酶。目前还没有白菜型油菜△8-鞘脂脱氢酶基因的相关报道。本研究以白菜型油菜为实验材料，通过电子克隆和PCR技术，克隆得到了4个白菜型油菜△8-鞘脂脱氢酶基因，分别命名为BrD8A、BrD8B、BrD8C和BrD8D。比较基因组学和系统发生分析表明这4个基因可分为两组，第一组包括BrD8A、BrD8C和BrD8D，而BrD8B为另外一组，这两组基因在拟南芥属和芸苔属分离之前就发生了分离。这4个基因的序列同源性较高，但是RT-PCR和启动子分析表明这4个基因具有不同的表达模式：BrD8A、BrD8C和BrD8D在所检测的器官中都表达，但是在表达的具体部位上有差异；而BrD8B则可能为花粉特异性表达。将BrD8A/B/C/D与绿色荧光蛋白基因GFP融合构建融合表达载体，对其表达蛋白进行定位，发现在烟草表皮细胞中定位于内质网中。将获得的基因构建酵母表达载体转入酵母中鉴定基因的功能，确定BrD8A侣/C/D都编码有功能的△8-鞘脂脱氢酶，但具有不同的生化功能，即生成的两种产物的比例不同。与转空载的酵母细胞相比，转BrD8A/B/C/D基因的酵母细胞对铝离子的抗性有不同程度的增加。将其中的一个基因BrD8A转入拟南芥中可使其叶片长链基的8(Z)-植物鞘氨醇：8(E)-植物鞘氨醇的比例由野生型的1:3转变为1:2。以上研究结果为植物△8-鞘脂脱氢酶的生化功能多样性和进化关系提供了新的视点，并为进一步研究8(Z)-植物鞘氨醇和8(E)-植物鞘氨醇的生物合成奠定了基础。
为了进一步研究对△8-鞘脂脱氢酶活性有重要影响的氨基酸残基，我们对来自不同物种的△8-鞘脂脱氢酶和△6-脂肪酸脱氢酶进行序列对比分析。除了已知的保守的Cytb5 HPGG基序和三个组氨酸box之外，发现了15个完全保守的氨基酸残基。其中，氨基酸残基H63、N203、D208、D210和G368对酶活性是必需的，F59、W190、W345、L369和Q372对酶活性也很重要。并且，将W190、L369和Q372替换为其它的氨基酸对△8-鞘脂脱氢酶催化生成的两种产物的比例有重要影响。这些研究结果为我们提供了△8-鞘脂脱氢酶活性的分子基础，并使我们对膜结合的脱氢酶结构和功能的关系有了更深刻的了解。
最后，为了研究△8-鞘脂脱氢酶的功能和进化的关系，我们从12种植物中克隆得到20条△8-鞘脂脱氢酶基因序列。按其功能可分为两类，即倾向于生成E式产物的和倾向于生成Z式产物的△8-鞘脂脱氢酶。倾向于生成Z式产物的△8-鞘脂脱氢酶与倾向于生成E式产物的△8-鞘脂脱氢酶相比，其转化效率普遍较低。进化分析推测，在高等植物中这两类△8-鞘脂脱氢酶可能分别有着各自的祖先，但是最初都是由低等生物如酵母中只能生成E式产物的△8-鞘脂脱氢酶逐步演化而来的。这些研究结果为了解△8-鞘脂脱氢酶的功能和进化的关系提供了新的视点。