【摘 要】
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细菌抗生素耐药已经成为一个全球性问题。虽然细菌对高浓度抗生素的抗性已经被广泛研究,但其在低浓度抗生素处理下的耐药机制研究仍相对较少。值得注意的是,低浓度抗生素存在于多数环境中。因此,本文以铜绿假单胞菌作为模式菌株,利用连续传代实验,结合基因组测序、定量PCR、基因敲除、转录组分析等技术,研究了其在亚致死氨苄西林处理下的耐药进化及其驱动机制。该研究不仅丰富了细菌耐药进化的相关认知,亦为抗生素抗性这一
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细菌抗生素耐药已经成为一个全球性问题。虽然细菌对高浓度抗生素的抗性已经被广泛研究,但其在低浓度抗生素处理下的耐药机制研究仍相对较少。值得注意的是,低浓度抗生素存在于多数环境中。因此,本文以铜绿假单胞菌作为模式菌株,利用连续传代实验,结合基因组测序、定量PCR、基因敲除、转录组分析等技术,研究了其在亚致死氨苄西林处理下的耐药进化及其驱动机制。该研究不仅丰富了细菌耐药进化的相关认知,亦为抗生素抗性这一公共健康问题的解决提供了参考。得到的主要研究结果如下:（1）铜绿假单胞菌在亚致死氨苄西林处理下能快速发生耐药进化,且不同浓度抗生素处理下细菌发生耐药进化的速度存在显著差异。在低浓度处理（15～30μg/m L）6天后,细菌耐药进化趋于稳定,继续传代并没有导致细菌最小抑菌浓度（MIC,minimum inhibitory concentration）的明显升高。到了第21天,低浓度处理组菌株的MIC是野生株的3～5倍;高浓度处理（150～300μg/m L）组菌株的MIC是野生株的15～18倍。（2）低浓度和高浓度抗生素处理下铜绿假单胞菌的耐药进化特征存在差异。基因组重测序结果显示mpl基因突变频繁地发生在低浓度处理组（15～30μg/m L）,amp D基因突变则主要出现在高浓度处理组（150～300μg/m L）;进一步基因敲除结果显示,Δmpl基因敲除株的MIC和β-内酰胺酶活性分别为8000±1000μg/m L和2.3±0.5 m U/mg,与低浓度处理组相近;Δamp D基因敲除株的MIC和β-内酰胺酶活性分别为20000±5000μg/m L和4.6±0.6 m U/mg,与高浓度处理组相近。该结果表明低浓度组和高浓度组耐药进化可能分别与mpl和amp D基因突变和相关突变株富集相关。（3）亚致死氨苄西林处理下铜绿假单胞菌的耐药进化可能与mpl和amp D基因突变导致的群体感应改变相关。对比野生株,胁迫浓度下Δmpl和Δamp D中多数群体感应基因las A、las R、rhl A、rhl B、rhl I、rhl R的转录水平出现了不同程度的上调。进一步添加200 mg/L的猪肾酰化酶作为群体感应淬灭剂,发现对比无群体感应淬灭剂添加组,Δmpl在2000μg/m L氨苄西林中的生长OD600从0.3降到了0.15;Δamp D则从0.4降到了0.2。淬灭剂添加显著降低耐药菌对抗生素的耐受能力,提示群体感应与亚致死氨苄西林处理下铜绿假单胞菌的耐药有关。（4）群体感应系统Rhl IR的上调是铜绿假单胞菌Δmpl和Δamp D耐药的重要原因之一。敲除耐药菌Δmpl和Δamp D的Las IR系统,菌株的MIC没有发生显著改变;但是,敲除耐药菌Δmpl和Δamp D的Rhl IR系统,ΔmplΔrhl I、ΔmplΔrhl R的MIC由8000μg/m L分别降到了2000μg/m L和1000μg/m L,Δamp DΔrhl I、Δamp DΔrhl R的MIC则由20000μg/m L分别降到了5000μg/m L和3000μg/m L,耐药性显著降低;进一步在群体感应系统Rhl IR突变株中加入信号分子C4-HSL,突变株ΔmplΔrhl I和Δamp DΔrhl I的MIC分别上升到5000μg/m L和10000μg/m L,信号回补导致耐药能力显著回升。该结果说明相较于LasIR系统,RhlIR系统对于铜绿假单胞菌耐药的贡献更大。
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