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目的：构建Ki67启动子调控的荷载PARP1shRNA的条件增殖型腺病毒，研究其在体外对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468的影响。 方法：1.由公司设计、构建靶向PARP1基因的四个重组质粒pGPU6-PARP1shRNA(s1，s2，s3，s4)，瞬时转染MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，RT-PCR及Western Blot检测四个PARP1shRNA的干扰效果，筛选最佳干扰质粒。2.以有效pGPU6-PARP1shRNA为模版，设计针对干扰序列的引物，并引入EcoRI、XhoI酶切位点，PCR扩增得到特异性的干扰片段，EcoRI/XhoI双酶切并纯化PCR产物，克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13（实验室保存）的相应位点中，构建质粒pCA13-PARP1shRNA1。同时选取干扰效率较低的PARP1shRNA3片段，以类似方法构建质粒pCA13-PARPshRNA3做为对照。BglⅡ酶切质粒pCA13-PARP1shRNA，回收CMV+PARP1shRNA+PolyA片段，克隆进pZKi67-ZD55质粒（实验室前期构建）的BglⅡ位点，构建pZKi67-ZD55-PARP1shRNA，PCR及测序鉴定。3.pZKi67-ZD55-PARP1shRNA与腺病毒骨架质粒pBHG10通过Lipofectamine2000共转染293细胞，9-14天后出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取病毒DNA进行PCR鉴定。4.重组的腺病毒单独或与顺铂联合使用，分别处理MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞，Western Blot检测两细胞中腺病毒E1A蛋白的表达情况;RT-PCR、Western Blot检测两种细胞中PARP1 mRNA和蛋白的情况;CCK-8法检测腺病毒单独或联合顺铂处理后对细胞增殖的影响;结晶紫染色检测腺病毒单独或联合顺铂处理后的细胞毒性作用。 结果：1.瞬时转染后，RT-PCR及Western Blot的实验结果表明，质粒pGPU6-PARP1shRNA1所携带的序列为有效的PARP1干扰序列。同时，选取干扰效果较差的pGPU6-PARP1shRNA3质粒，构建对照质粒。2.PCR及测序证实pZKi67-ZD55-PARP1shRNA1、pZKi67-ZD55-PARP1shRNA3构建成功。3.PCR鉴定重组的腺病毒Ki67-ZD55-PARP1shRNA1、Ki67-ZD55-PARP1shRNA3含有目的基因，并且没有野生病毒的污染。4.腺病毒Ki67-ZD55-PARP1shRNA1、Ki67-ZD55-PARP1shRNA3分别单独及与顺铂联合，感染乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞，Western Blot结果显示，两组病毒均能表达E1A蛋白，RT-PCR及Western Blot结果显示，两种细胞中Ki67-ZD55-PARP1shRNA1联合顺铂处理组,PARP1 mRNA和蛋白的表达水平明显降低，与其它组和空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。5.CCK-8、结晶紫染色法的实验结果均显示，腺病毒Ki67-ZD55-PARP1shRNA1联合顺铂处理组具有较强的杀伤细胞作用，而Ki67-ZD55-PARP1shRNA3联合顺铂处理组、Ki67-ZD55-PARP1shRNA1、Ki67-ZD55-PARP1shRNA3单独处理组对两种乳腺癌细胞的杀伤作用较弱。 结论：1.成功构建Ki67启动子调控的、携带有效PARP1shRNA的条件增殖型腺病毒Ki67-ZD55-PARP1shRNA1。 2.腺病毒Ki67-ZD55-PARP1shRNA1能有效抑制乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞中PARP1的表达，与顺铂联合作用后，能够增强顺铂对两种细胞的杀伤作用。