杆状病毒形成多角体膜关键结构域的研究及其在抗紫外线方面的应用

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杆状病毒作为环保型生物杀虫剂已经成功用于农、林、牧业害虫的防治,但对紫外线(Ultraviolet,UV)的敏感性严重制约了它们在更大规模的应用。杆状病毒的多角体膜是保持包涵体在环境中稳定存在的重要结构,它由糖类和多角体膜蛋白(polyhedron envelope protein, PEP)组成。本论文对PEP蛋白的种属特异性以及多角体膜结构形成的关键结构域进行了研究,在此基础上构建了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa calif ornica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的PEP的关键结构域融合纳米ZnO结合多肽的重组病毒,并对其抗紫外线活性进行了测定。主要内容如下:  第1章对杆状病毒的研究现状进行了概述。首先介绍了杆状病毒的分类、生活史以及多角体膜的基本特性;随后介绍了杆状病毒杀虫剂及表面展示系统的研究进展,同时对分子仿生材料学作了简要的介绍;最后阐述了本论文的研究内容和意义。  第2章对不同的杆状病毒pep同源物替换AcMNPV pep基因后多角体膜的形态进行了研究。通过已知的PEP蛋白序列构建了系统发育进化树,发现杆状病毒在PEP的进化上可以分为GroupⅠ Nucleopolyhedrovirus(NPV)、GroupⅡ NPV和Granulovirus(GV)三支。将分别来自GroupⅡ NPV和GV的四种pep同源物回复进缺失pep的AcMNPV Bacmid,扫描电镜观察结果显示,这些重组病毒的包涵体表面均呈现坑洼状,说明杆状病毒的PEP蛋白具有种属特异性,同源物不能代替AcMNPV自有PEP的功能。  第3章鉴定了AcMNPV的多角体膜结构形成的关键结构域,并对PEP不同结构域携带外源蛋白展示于包涵体表面的能力进行了探索。通过对GenBank中公布的33种NPV和14种GV的PEP蛋白氨基酸序列比对,发现NPV和GV之间N端(N区)以及C端(C区)具有保守性,而中间区(M区)差异较大。通过观察一系列截短的PEP与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合的重组病毒包涵体表面结构与荧光情况,发现只有PEP的NM区结构域和野生型病毒一样能够形成完整的多角体膜,同时除了单独的N区外,PEP的其它结构域均能将外源的eGFP展示于包涵体的表面。  第4章对包涵体表面展示纳米ZnO结合肽提高杆状病毒紫外线抗性进行了研究。在第3章的基础上,构建了AcMNPV PEP的NM区融合纳米ZnO结合肽的重组病毒,Western blot及免疫荧光电镜结果表明,ZnO结合肽成功展示于包涵体的表面。在实验室条件下,多角体表面包含纳米ZnO结合肽的重组病毒与纳米ZnO颗粒特异结合并经UV-B照射处理后,其感染性大约是未结合纳米ZnO的9倍;而室外条件下的盆栽实验结果也显示,特异结合纳米ZnO的重组病毒的半数存活时间(3.3±0.15天)要比混合了纳米ZnO的对照病毒的半数存活时间(0.49±0.06天)显著地延长。这种策略为提高杆状病毒在野外条件下的紫外线抗性提供了新的思路。
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