肺癌死亡率在世界范围内居恶性肿瘤首位,虽然近年来一些新化疗药物的出现,其治愈率仍然<15%。HER2/neu(erbB2)基因,为表皮生长因子受体(EGFR)家族成员,其编码蛋白为185KDa,具有酪氨酸蛋白激酶活性,与EGFR高度同源。HER2/neu受体可以与家族其他成员形成异源二聚体,从而发挥强有力的肿瘤信号传导作用。研究显示,HER2/neu介导的信号传导与肿瘤的形成、增值、转移、侵袭及放化疗耐药有关。约1/3非小细胞肺癌(NSCLC)存在HER2/neu过表达,HER2/neu过表达在NSCLC形成、增值、转移、侵袭等方面的作用尚需进一步研究证实。RNA干涉(RNAi)是双链RNA(dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默((PTGS )现象,广泛存在于多种自然界。RNAi的核心功能是抗病毒感染免疫,维持基因组中转座子的稳定性,清除异常RNA,同时参与基因表达调控。目前,RNAi技术己发展成为一种新型的基因阻断技术,用于高效特异地关闭或降低特定基因的表达,广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定以及基因治疗等方面,在肿瘤、病毒感染等治疗方面已取得积极进展,显示了非常广阔的应用前景。但是,针对HER2/neu的RNAi对NSCLC的研究报道少见。研究目的本研究利用siRNA沉默肺癌细胞HER2/neu表达后,通过体外体内系列实验观察肿瘤细胞生物学行为的改变,了解HER2/neu基因在肺癌发生、发展中的作用,检测RNA干涉效果并探讨该方法应用于肺癌基因治疗的潜在药用价值,为肺癌的治疗提供一条新思路。研究内容1.根据人HER2/neu mRNA基因编码区序列,设计并合成针对HER2/neu的4条64nt的小发夹RNA(shRNA)模板脱氧寡核苷酸序列,首先构建针对HER2/neu的siRNA表达质粒pSUPER-siHER1和pSUPER-siHER2,并进行酶切鉴定和DNA测序;然后将构建正确的pSUPER-siHER2 H1启动子连同编码siRNA的模板序列用EcoR I和Xho I切出,再连接入去除CMV启动子的pcDNA3.0载体,构建带有新霉素抗性筛选标志的pcDNA3.0-siHER2表达质粒,并进行酶切鉴定。