研究背景及目的:　　 锰(manganese,Mn)广泛地存在于地壳、空气的微粒以及水中。它是人体必需的微量元素之一,参与体内很多重要的代谢过程。但过量接触锰及其化合物能够引起慢性锰中毒,表现为运动徐缓与肌张力减弱为主的锥体外系神经功能障碍,类似于帕金森病。有研究报道,当血锰浓度接近生理浓度时,主要通过血-脑屏障(bood brain barrier,BBB)的毛细血管内皮细胞入脑;而当血锰浓度过高时,主要通过血.脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,BCB)进入脑脊液及脑组织。　　 血-脑脊液屏障主要是由室管膜内陷于第三、四脑室与侧脑室分化形成的脉络丛(choroid plexus,CP)组织上皮细胞问的紧密连接所构成,负责外周血循环与CSF循环之间的物质转运。脉络丛不仅可以不断地分泌脑脊液以支持、保护、营养脑组织,它还通过结合的方式将血液中过量的有毒物质(如锰离子、铅离子等)蓄积在组织内,从而稳定脑脊液的成分,保护脑实质,避免神经系统的代谢及功能发生紊乱。但脉络丛的这种蓄积能力是有限的,当有毒物质蓄集过量时便会破坏脉络丛的结构和功能,进而破坏血.脑脊液屏障的屏蔽功能,使得脉络丛组织成为外界毒物进入中枢神经系统的首个毒性靶部位。但是,锰毒性作用下,脉络丛的这种屏蔽保护作用和毒性损伤机制并未得到充分的研究。　　 本文采用永生化的大鼠脑脉络丛细胞系Z310,研究低剂量氯化锰(MnCl2)对Z310细胞增殖的促进效应(低剂量兴奋效应)及高剂量MnCl2对该细胞增殖的抑制效应,在光镜和电镜下观察细胞及亚细胞形态学改变,应用流式细胞技术检测MnCl2对Z310细胞周期和凋亡的影响,并对本实验室体内实验所筛检出的CP中MnCl2毒性相关蛋白—应激性磷蛋白1(stress-inducedprotein1,STIP1)进行体外验证,通过RNA干扰技术建立STIP1基因沉默型细胞系,初步确定这些蛋白在MnCl2细胞毒性中的作用,深入探讨MnCl2的脑脉络丛上皮细胞毒性分子机制。　　 研究内容:　　 1.MnCl2对脑脉络丛上皮细胞Z310细胞增殖的影响以脑脉络丛上皮细胞Z310细胞为靶细胞,分别采用MTT法和WST-8法观察低剂量MnCl2(0.00005、0,0005、0.005、0.05、0.5、5、20、50pmol/L)和高剂量MnCl2(50、100、200、400、800、1000、1600μmol/L)对Z310细胞增殖的影响。　　 2.MnCl2对Z310细胞形念以及超微结构的影响分别在光镜下和透射电子显微镜下观察200、400及800μmol/L的MnCl2作用48小时后,Z310细胞形态及其亚细胞超微结构的改变。　　 3.MnCl2对Z310细胞的细胞周期及凋亡的影响采用流式细胞术检测0、50、100、200、500μmol/L的MnCl2作用于Z310细胞24及48小时后周期时相及细胞凋亡的改变。　　 4.STIP1在MnCl2所致的Z310细胞周期影响中的可能作用及其分子机制检测0、50、100、200μmol/L的MnCl2作用24h后,Z310细胞内STIP1蛋白、Erk1/2蛋白及其磷酸化蛋白、Akt蛋白及其磷酸化蛋白表达水平的变化,并采用SiRNA干扰技术抑制STIP1蛋白的表达,进而研究STIP1在MnCl2所致的Z310细胞周期影响中的可能作用及其分子机制。　　 结果:　　 1.MnCl2对脑脉络丛上皮细胞Z310细胞增殖的影响高剂量(100-1600μmol/L)MnCl2对细胞增殖具有明显的剂量依赖性的抑制作用(24h和48h两个时间点的剂量与细胞抑制率的相关系数分别为-0.921和-0.947,P＜0.01),而低剂量(0.00005-5μmol/L)MnCl2对细胞增殖的作用表现为促进的趋势。　　 2.MnCl2对Z310细胞形态以及超微结构的影响　　 200、400及800μmol/L的MnCl2作用48h后,Z310细胞与对照组相比细胞数量明显减少,排列不紧凑,且多边形态不明显,呈类梭状生长,核膜皱缩,核质浓缩、边缘化,线粒体出现缺嵴空泡化,胞质空泡化。　　 3.MnCl2对Z310细胞周期及细胞凋亡的影响高剂量(100、200、400、800μmol/LMnCl2)分别作用于Z310细胞24h后,染毒组与对照组相比,处于G0/G1期的细胞比例从1.8%增加到7.6%,48h后从5.0%增加到19.2%,表明MnCl2能将Z310细胞周期阻滞在G0/G1期。50、100、200μmol/L的MnCl2分别作用于Z310细胞24h后,染毒组细胞早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率与对照组相比,均无差异;当剂量增加到500μmol/L时,Z310细胞的晚期凋亡及坏死率比对照组增加了8.34%,差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 我们进一步采用另外一种细胞系(多巴胺能神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞)以及另外一种化学诱导剂5-fluorouracil(已被公认的细胞凋亡诱导剂)来证实上述凋亡检测方法和结果的可靠性。以50、100、200、500μmaol/L的MnCl2作用于SH-SY5Y细胞24h后,随着染锰剂量的增加,细胞早期凋亡率、晚期凋亡/坏死率呈增加趋势,其中200、500gmol/L的MnCl2引起的SH-SY5Y细胞早期凋亡率比对照组分别增加4.67%、9.47%,差异有统计学意义(P＜0.05);100、200、500μmol/L的MnCl2引起的SH-SY5Y细胞晚期凋亡/坏死率分别比对照组增加5.87%、22.17%、25.17%,差异均有统计学意义(P＜0.05)。以12.5μmol/L凋亡诱导剂5-fluorouracil分别作用于Z310细胞和SH-SY5Y细胞24h后,与对照组相比,Z310细胞和SH-SY5Y细胞早期凋亡率分别增加21.71%,9.8%;晚期及坏死率分别增加13.63%,23.67%,均有统计学意义(P＜0.05)。3.STIP1在MnCl2所致的Z310细胞周期影响中的可能作用及其分子机制探讨50、100、200、400μmol/L的MnCl2作用于Z310细胞24h后,Z310细胞内STIP1蛋白上调(P＜0.05),MAPK信号通路中的关键蛋白Erk1/2的磷酸化水平无明显变化(P＞0.05),而PI3K通路中的关键蛋白Akt的磷酸化水平下调(P＜0.05)。我们将Z310细胞内STIP1蛋白敲低至原有水平的13%后,进行染锰(400μmol/L)后细胞周期的测定。检测结果显示STIP1蛋白表达水平的降低对锰所致的Z310细胞周期改变趋势并无影响,且对Z310细胞内Erk1/2和Akt磷酸化水平也无影响。　　 结论:　　 1.低剂量(0.00005～5μmol/L)MnCl2作用于脉络丛上皮Z310细胞24h和48h后对其细胞增殖具有促进作用。　　 2.高剂量(100～1600μmol/L)MnCl2作用于Z310细胞24h和48h对其细胞增殖具有抑制作用,且具有剂量效应关系。　　 3.高剂量MnCl2作用于Z310细胞24h和48h后可将周期阻滞在G0/G1期,PI3K/Akt信号转导通路在这个过程中可能发挥着作用。　　 4.高剂量MnCl2作用于Z310细胞24h和48h可造成细胞形态及超微结构发生病理性改变。　　 5.Z310细胞对MnCl2毒性的耐受性比SH-SY5Y细胞强,这可能与脉络丛上皮细胞是构成血-脑脊液的物质基础并发挥屏障功能有关。　　 6.STIP1在Z310细胞中表达,且在锰作用24h后上调,与体内锰中毒动物模型中CP组织STP1增高的结果一致。但STIP1低表达型的Z310细胞的染锰后细胞周期研究结果表明,STIP1蛋白水平的增高在锰引起的Z310细胞周期阻滞的过程中并不起关键性作用。