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牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）是一种小的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属的成员。该病毒对牛的生产性能影响极大,可以引起流产、产出畸形胎儿或者持续性感染小牛,这对养牛业造成了极大的经济损失。持续感染的动物通常比短暂或急性感染的动物更有效地传播BVDV,因为它们能够终生排毒,并且被认为是BVDV的主要宿主。近年来国内BVDV感染率较高且逐渐上升。此外,我国进口的牛数量逐渐增加,因此必须加强对BVDV的检疫和防控。国内目前在检测BVDV血清抗体时主要是病毒中和试验和商品化试剂盒,但病毒中和试验不适合血清的大规模检测,而商品化试剂盒价格昂贵。为此,本研究开展了建立检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法的研究,为国内BVDV的防控提供技术支持。BVDV最具免疫原性的蛋白包括结构蛋白Erns（E0）和E2及非结构蛋白P80,三者均可应用于检测牛血清中针对BVDV的抗体。其中E0和E2蛋白是BVDV结构蛋白,是其主要的免疫原,可诱导中和抗体,是抗体检测的主要靶标。P80蛋白是病毒的非结构蛋白,具有较强的免疫原性,病毒在机体内复制过程中也可诱导机体产生抗体,也是BVDV抗体检测的主要靶标。本研究将重组质粒pET30a-p80、pET30a-E0和pET30a-E2分别转化大肠杆BL21（DE3）表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了三种蛋白均以包涵体形式获得了表达。之后将纯化的三种重组蛋白分别作为包被抗原,建立了三种检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。同时,三种重组蛋白均只与BVDV阳性血清反应,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉阻断反应,特异性较强。以E2或者P80为包被抗原的ELISA方法敏感性试验显示阳性牛血清在1:1280倍稀释时仍呈阳性,表明这两种方法的敏感性较高。以E0为包被抗原的ELISA方法敏感性试验显示阳性牛血清在1:640倍稀释时呈阳性,表明该方法敏感性有待提高。三种ELISA方法的重复性试验显示批内变异系数均小于10%,批间变异系数小于10%,表明三种方法重复性较好。将三种方法分别与病毒中和试验进行比对,结果显示以E0为包被抗原的间接ELISA方法符合率为88.1%;以E2为包被抗原的间接ELISA方法符合率为95.1%;以P80为包被抗原的间接ELISA方法符合率为96.5%。重组E0蛋白的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率要远低于另外两种重组蛋白的间接ELISA方法。用重组P80蛋白建立的间接ELISA方法检测了采自国内2个不同地区的188份牛血清,血清阳性率为86.2%。用重组蛋白E2和E0分别建立的间接ELISA方法,分别检测了采自国内4个不同地区的384份牛血清,血清阳性率分别为88.02%和87.2%。此外,用上述三种间接ELISA方法对采自接种BVDV灭活疫苗牛群的224份血清进行了检测,223份牛血清都呈阳性。通过三种方法的比对,特别是重组蛋白E0与病毒中和试验的符合率较低的结果,可以初步认为以重组蛋白E2为包被抗原建立的间接ELISA方法更为特异,适合国内BVDV血清流行病学的调查,可为我国BVDV的防控提供技术支持。