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谷氨酸脱氨酶(GDH)普遍存在于生物体内,能够将NH4+氨化成谷氨酸,实现对氮素的固定。由于植物中的GDH对NH4+的亲和力比较低,所以植物主要是通过GS/GAGT途径实现对氮素的固定。微生物的GDH比植物的GDH对NH4+有更高的亲和力,在其氮代谢中起着重要作用。研究表明将某些微生物的GDH异源表达到植物中,能促进植物的氮素利用率提高。基于水稻是全球半数以上人的主食,将微生物GDH异源表达到水稻中,对解决粮食问题起重要作用。本文为研究真菌埃伦柱孢GDH基因CeGDH做了如下研究,主要的研究结果如下: 1.生物信息学分析表明真菌埃伦柱孢(Cylindrocarponehrenbergii)中的NADP(H)依赖的谷氨酸脱氢酶CeGDH与水稻和拟南芥的GDH氨基酸同源性比较低,却与黑曲霉(Aspergillusniger)的gdhA以及中间脉孢霉(Neurosporaintermedia)的NiGDH的氨基酸同源性比较高。 2.成功克隆了CeGDH并将其表达到水稻中(Oryzasativacv.Kitaake)。构建原核表达载体pCold-TF-CeGDH,通过IPTG诱导,得100KD重组蛋白。用纯化获得的CeGDH蛋白检测NADP(H)-GDH体外表达酶活。结果表明CeGDH氨化反应的酶活(3.24μmolmin-1mg-1)大于去氨化反应的酶活(0.28μmolmin-1mg-1)。 3.构建了亚细胞定位载体35∷CeGDH-YFP,将重组载体瞬时表达到拟南芥原生质体中,结果显示CeGDH-YFP是在氮素同化的场所细胞胞质中表达。 4.构建的植物过表达载体pCAMBIA1301GW-CeGDH,通过农杆菌侵染方法转入水稻。用半定量以及WesternBlotting方法对转基因进行鉴定。 5.提取转基因植株(Ubi∷CeGDH-7和Ubi∷CeGDH-33)和WT植株的总蛋白,用于测定转基因水稻体内的酶活。结果发现转基因株系酶活和体外酶活的结果相一致。NADPH依赖的酶活显示WT,Ubi∷CeGDH-7,Ubi∷CeGDH-33的氨化反应酶活分别为0.277,0.310,0.337μmolmin-1mg-1,去氨化反应分别为0.0452,0.0217,0.0250μmolmin-1mg-1。说明在CeGDH倾向于将酮戊二酸转化为谷氨酸。 6.水培实验表明与野生型WT相比,低氮浓度下的转基因水稻苗期的苗长根长以及氮素含量都明显高于WT。田间农艺学性状统计数据显示,低氮梯度下转基因株系的有效穗和单株重相比于WT有明显增加。 结果表明将CeGDH异源表达到水稻中,能够提高水稻的氮素利用率,促进水稻苗期生长以及产量的提高。