脱氧核糖核酸酶I高敏感位点(DHSs)在过去超过28年的时间里被研究者发现能够代表许多基因调控功能原件的位点,这包括增强子,绝缘子,启动子和位点控制区域等。脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)高敏感区域一般具有活跃的顺式调控序列特征。发现基因组中非编码的功能原件对于理解复杂的基因表达有着重要意义。通过鉴定基因组上哪些区域对于DNase I酶切敏感是发现有活性的功能原件的一种方法。我们能够通过研究DHSs,找到基因组的转录调控区域,进而研究生物的转录调控模式。在此,我们基于DNaseI-seq开发了一种新的方法,该方法能够降低样本起始量扩大了该方法的应用范围,该方法利用琼脂糖凝胶对DNA的保护作用降低DNA的损失,并且减少非酶切产生的DNA断裂,从而增加了DNaseI的敏感性,减少噪音信号,降低DHSs假阳性的可能性。为了解决样本起始量的问题,我们利用了Phi29 DNA聚合酶的多重链置换特性和强大的连续合成能力以及琼脂糖凝胶内的分子反应。首先利用离子去垢剂破坏细胞膜增加核膜的通透性,然后用脱氧核糖核酸酶I对细胞染色质进行酶切。通过控制酶切时间和酶浓度,我们控制产物片段分布在20-50kbp,因为Phi29能对该大小的DNA片段进行高效扩增。酶切完成后我们加入等体积1.2%的低熔点琼脂糖凝胶,待琼脂糖凝固后,大片段的DNA分子就被固定在凝胶内防止机械损伤。之后将琼脂糖凝胶块浸泡在裂解液中过夜,让DNA分子释放出来。去除裂解液后,我们在琼脂糖凝胶内对酶切后的DNA进行末端修复和接头连接。此过程中降低了假阳性的断点产生。完成接头连接后的琼脂糖凝胶块可以被融化,并且将琼脂糖凝胶的最终浓度控制在0.2%以下让琼脂糖不会凝固。此时我们对产物进行质量控制,利用QPCR对基因组和接头进行定量,量化接头连接效率。质量控制合格后我们用Phi29酶将DNA扩增至3μg,此时可以对DNA进行文库构建并且利用Complete Genomics的测序平台进行测序。最后得到的测序数据比对到基因组和接头序列,可以找到酶切断点即DHS位点。