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肌内脂肪（IMF）又称为大理石纹脂肪,其含量决定了牛肉的质量评价等级。IMF沉积包括前体脂肪细胞的增殖、分化、成熟以及脂质代谢等多个生理过程,而能够在以上过程中发挥重要调控作用的基因在分子育种研究中备受关注。关于人类和小鼠的相关研究表明,Sirtuins基因家族参与细胞的诸多生物学过程,并在维持葡萄糖和脂质代谢平衡、调控胰岛素分泌和敏感性、促进脂肪动员、氧化应激反应以及由肥胖引起的巨噬细胞炎症等生理生化过程中发挥着重要调控作用。其中SIRT5定位于线粒体中,与机体的能量平衡、细胞代谢、疾病发生等生物学过程紧密相关;SIRT6主要定位于细胞核中,对葡萄糖和脂质体稳态有重要调控作用。然而,关于Sirtuins基因对牛前体脂肪细胞分化的调控作用及其分子机制还有待研究。本研究利用腺病毒介导SIRT5和SIRT6基因在牛前体脂肪细胞中过表达或干扰,同时结合分子生物学、细胞生物学等相关技术系统研究SIRT5和SIRT6基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的调控作用;在此基础上,通过转录组测序（RNA-Seq）技术,深入探究SIRT5和SIRT6基因调控前体脂肪细胞分化的分子机制和作用通路;此外,本研究以小鼠为模式动物,在活体水平验证SIRT5和SIRT6对脂肪组织分化和脂质合成的抑制作用,以及SIRT5的抗氧化应激作用。主要研究结果如下:1.SIRT5对牛前体脂肪细胞分化和线粒体氧化应激的调控作用本试验利用实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质免疫印迹（WB）技术在牛前体脂肪细胞及小鼠活体水平上检测脂肪细胞分化标志基因的表达水平变化,同时结合油红O染色、苏木精—伊红（HE）染色、和免疫荧光染色等形态学鉴定手段,以及RNA-Seq技术研究了SIRT5对前体脂肪细胞分化和线粒体氧化应激的调控作用及分子机制。结果如下:（1）SIRT5抑制牛前体脂肪细胞分化;（2）SIRT5抑制牛前体脂肪细胞的周期阻滞;（3）SIRT5促进牛前体脂肪细胞的线粒体生物合成;（4）SIRT5缓解牛前体脂肪细胞的线粒体氧化应激;（5）SIRT5通过激活AMPK通路与阻遏MAPK通路抑制牛前体脂肪细胞分化;（6）小鼠活体验证SIRT5抑制脂肪组织中脂肪细胞分化和脂质沉积,并缓解脂肪组织的氧化应激反应。2.牛SIRT5基因转录调控的分子机制为了阐明牛SIRT5基因表达的转录调控分子机制,本研究克隆了SIRT5基因2-kb启动子片段,利用生物信息学预测结果构建转录因子定点突变载体,并结合双荧光素酶报告系统、凝胶迁移实验（EMSA）和染色质免疫共沉淀（Ch IP）等技术确定了SIRT5基因的核心启动子区域、区域内转录因子的结合位点以及转录因子的调控作用。此外,利用超甲基化和去甲基化技术研究了DNA甲基化对转录因子调控功能的影响。结果如下:（1）牛SIRT5基因的核心启动子区域为-343/-127 bp;（2）发现并验证KLF2、PPARα、MYOD、E2F4和NRF1是SIRT5基因的转录激活因子,CEBPβ和KLF6是SIRT5基因的转录抑制因子;（3）SIRT5基因启动子的甲基化水平伴随着前体脂肪细胞的分化进程而显著升高;（4）在前体脂肪细胞分化过程中,E2F4、KLF6与DNA甲基化竞争性调控SIRT5基因的启动子活性。3.SIRT6对牛前体脂肪细胞分化的调控作用本试验利用qPCR和WB技术并结合油红O染色、HE染色和免疫荧光染色等形态学鉴定手段以及RNA-Seq技术,研究了SIRT6对前体脂肪细胞分化的调控作用及分子机制。结果如下:（1）在牛前体脂肪细胞中干扰SIRT5基因能够显著上调SIRT6基因的表达水平;（2）SIRT6抑制牛前体脂肪细胞的分化;（3）SIRT5和SIRT6协同抑制牛前体脂肪细胞的分化和脂质沉积;（4）SIRT6抑制牛前体脂肪细胞的周期阻滞;（5）SIRT6通过激活AMPK通路抑制牛前体脂肪细胞的分化;（6）小鼠活体验证SIRT6抑制脂肪组织中脂肪细胞分化和脂质沉积。4.牛SIRT6基因转录调控的分子机制为了阐明牛SIRT6基因表达的转录调控分子机制,本试验克隆了SIRT6基因2-kb启动子片段,利用双荧光素酶报告系统、EMSA、Ch IP、超甲基化和去甲基化等技术确定了SIRT6基因的核心启动子区域、区域内转录因子的调控功能以及甲基化对转录调控的影响。结果如下:（1）牛SIRT6基因启动子的核心功能区域为-472/-73 bp;（2）PAX6、KLF2和NRF1为SIRT6启动子的转录激活因子,CEBPβ、CMYB和E2F1为转录抑制因子;（3）已分化脂肪细胞中SIRT6基因启动子Cp G位点的甲基化水平显著高于未分化脂肪细胞;（4）去甲基化能够增强SIRT6基因启动子活性,并且增强NRF1对SIRT6启动子活性的激活作用以及E2F1对SIRT6启动子活性的抑制作用。综上所述,SIRT5和SIRT6均对牛前体脂肪细胞的分化及细胞周期阻滞具有抑制作用;SIRT5能促进牛前体脂肪细胞中的线粒体生物合成并缓解线粒体氧化应激;此外,SIRT5和SIRT6能够协同抑制牛前体脂肪细胞的分化和脂质沉积。本研究系统揭示了SIRT5和SIRT6基因在牛前体脂肪细胞分化、脂质代谢、线粒体应激等方面的分子调控机制,能够为肉牛分子育种工作提供理论基础,为肉牛IMF发育、沉积以及肉品质的改善提供研究依据,也能够为脂质代谢疾病、Ⅱ型糖尿病和肥胖症的治疗提供参考思路。