研究背景：研究统计,近年来结直肠癌(colorectal cancer, CRC)一直是世界范围内发病率和致死率位居前三的恶性肿瘤之一,每年全球都有数百万新发病例及约600,000人死于结直肠癌。随着饮食习惯和饮食结构的改变,我国结直肠癌发病率和死亡率也呈上升趋势。由于结直肠癌早期临床症状不明显,大多数患者确诊时已属中晚期。目前结直肠癌的发生发展及免疫逃逸机理仍不明确,对于丧失手术时机的结直肠癌患者仍缺乏更有效的治疗方法。因此,寻找理想的结直肠癌早期诊断和预后评价指标以及理想的治疗靶点十分必要。自然杀伤(Natural killer, NK)细胞是机体重要的先天免疫效应细胞,能清除体内的肿瘤细胞、被病毒或细菌感染的细胞等,发挥天然免疫监视功能。NK细胞表面存在多种活化性和抑制性受体,其细胞毒作用的发挥就依赖于各种活化和抑制信号的综合。NKG2A(Natural-killer group2, member A)是NK细胞表面的一种重要的抑制性受体,特异性识别和结合其配体HLA-E,向NK细胞传递抑制信号。NKG2D(Natural-killer group2, member D)是NK细胞表面的一种主要的活化性受体,特异性识别和结合其配体MICA/B、ULBPs后,向NK细胞传递活化信号。多项研究表明,NKG2D介导的NK细胞毒作用下降可能是造成肿瘤细胞免疫逃逸的原因之一。调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)是机体重要的免疫抑制性细胞,可抑制CD8+CTL细胞、NK细胞及树突状细胞(dendritic cells, DCs)等多种免疫效应细胞的功能,是肿瘤免疫逃逸的关键因素。目前天然CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞是研究最为深入的一类Treg细胞。叉头转录因子(Forkhead box protein3, Foxp3)是Treg细胞最关键的细胞内标志物,对于Treg细胞的分化和功能维持具有重要作用。研究发现Treg细胞在结直肠癌、肝癌、卵巢癌及前列腺癌等患者外周血和肿瘤局部微环境中比例增高,且Treg细胞水平与患者肿瘤进展及预后呈负相关；在肿瘤切除后Treg细胞恢复到正常水平,而肿瘤复发时Treg细胞增多。研究报道,Treg细胞可以通过细胞接触依赖机制(cell-contact-dependant mechanism)及分泌转化生长因子(transforming growth factor, TGF)β、IL-10等免疫抑制性细胞因子抑制NK细胞的活化,从而使肿瘤细胞逃避免疫监视。然而,Treg细胞与NK细胞受体NKG2A、NKG2D在结直肠癌中的表达、相互关系及临床意义尚不明了。基于上述研究现状,为了深入认识Treg细胞、NK细胞及其受体NKG2A与NKG2D表达在结直肠癌患者中的临床意义,以便为结直肠癌的诊断和治疗提供新的思路和实验依据,本研究确定研究目的及研究方法如下。研究目的：1.观察CRC患者外周血中NK细胞抑制性受体NKG2A及活化性受体NKG2D在mRNA水平及蛋白水平的表达情况。2.观察封闭纯化NK细胞受体NKG2D表达对NK细胞毒作用及脱颗粒作用的影响。3.观察CRC患者外周血中Treg细胞水平及其与淋巴结转移、临床分期的关系。4.平行测定CRC患者外周血中Treg细胞水平、NKG2D+NK细胞水平及血清癌胚抗原(carcino-embryonic antigen, CEA)水平,评价它们的相关性。研究方法：1.患者与对照CRC患者97例(男52例,女45例)收自山东省立医院胃肠外科。所有患者的确诊根据卫生部颁布的结直肠癌诊断标准(2010),并排除合并糖尿病、肾病、肝病或其它自身免疫性疾病,标本收集前均未接受放、化疗。健康对照48例(男26例,女22例)收自山东省立医院健康查体中心。本课题得到山东大学附属山东省立医院伦理委员会的批准。2.细胞与细胞培养抽取研究个体15mL抗凝静脉血,用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。采用免疫磁珠方法阴性分选NK细胞,流式细胞术测定CD3-CDC6+NK细胞纯度达95%。获得的NK细胞在含10%灭活胎牛血清(fetal calf serum, FCS)、1%青链霉素的RPMI1640培养基中培养,加入100U/mL重组人白介素(recombinant human interkin, rIL)2,在37℃及5%CO2孵箱中孵育。人结肠癌细胞株HT29作为靶细胞,在含10%灭活FCS、1%青链霉素的RPMI1640培养基中培养,在37℃及5%CO2孵箱中孵育。2-3天更换1次培养基,细胞在使用前洗2次。在抗体封闭试验中,NK细胞先与不同浓度抗NKG2D中和抗体孵育30min,然后与靶细胞HT29共同孵育,之后进行细胞毒试验及CD107a脱颗粒试验。3.实时定量PCR总RNA根据厂家说明书用TRIzol试剂从PBMCs中提取。提取的总RNA的浓度和质量由测定的吸光度A260及A260/A280比率评价。反转录体系(20μL)包括：1μg总RNA,2μL的Maxima enzyme mix,4μL的5×PCRmix。反转录程序如下：25℃10min,55℃30min,85℃5min。获得的cDNA在用于PCR扩增前作10倍稀释。引物包括：CD94, NKG2A, NKG2D及β-actin。PCR反应体系(20μL)包括：5gL的cDNA,5μL的0.8μM上下游引物,10μL的2×PCR mix。扩增程序如下：95℃5min,然后45个循环：95℃15sec,60℃30sec,72℃15sec。用96孔板在罗氏LightCycler480序列测定系统上合成PCR产物。最后,将PCR产物电泳以评价是否合成了要求的产物。4.流式细胞术NKG2A和NKG2D检测属于表面抗原检测,用10μL抗人CD3抗体,5μL抗人CD56抗体,10μL抗人NKG2A抗体,10μL抗人NKG2D抗体对PBMCs染色,同时使用同型对照。Treg细胞用调节性T细胞试剂盒参照厂家说明书测定。对于表面抗原染色,在100μL全血中加入10μL抗人CD4抗体和10μL抗人CD25抗体,4℃避光孵育30min。然后室温加入1×RBC Lysis Buffer溶解红细胞。对于细胞内抗原染色,需要先破坏细胞膜,在细胞中加入fixation/permeabilization workingsolution,避光孵育60min。然后加入10μL抗人Foxp3抗体染色。同时使用同型对照抗体。对于CD107a脱颗粒测定,将NK细胞与HT29在37℃混合培养,培养体积为200μL,然后每孔加入10μL抗人CD107a抗体。37℃孵育1h后,加入1.7μL莫能霉素(0.1mg/mL),再孵育3h。同时设对照孔。收集细胞后,再加入10gL抗人CD3抗体及5gL抗人CD56抗体进行表面抗原染色。用EPICS XL流式细胞仪(Beckman Coulter)或BD FACS II流式细胞仪(BDBiosciences)至少计数10,000个细胞。5.细胞毒测定采用51Cr释放试验,纯化NK细胞作为效应细胞,HT29作为靶细胞。HT29与S1Cr同位素在37℃孵育1h。被标记的靶细胞与NK细胞以不同效靶比共孵育4h。收集上清,用y-counter(Packard Cobra Ⅱ5002)分析。计算51Cr释放百分率。自发性释放应小于最大释放的15%。6.血清CEA测定非特异性肿瘤标志物CEA作为CRC患者的诊断、疗效监测和预后判断指标,在我院生化室采用罗氏Cobas e601系统检测。在健康人群中,CEA的参考范围是0-10ng/L。7.统计学分析采用GraphPad Prism软件对数据进行统计学分析。t test用于比较2个组之间的可数变量结果。one-way Anova用于比较3或4组之间的可数变量。Spearman correlation analysis用于判断2个变量之间的相关性。p<0.05被认为具有统计学意义。结果：1.CRC患者外周血NKG2A在mRNA水平、蛋白水平及NK细胞表面的表达水平均与健康对照相似；而NKG2D在mRNA水平、蛋白水平及NK细胞表面的表达水平均显著低于健康对照。2.用抗NKG2D中和抗体封闭NKG2D路径后,NK细胞毒作用及CD107a脱颗粒均随着抗NKG2D中和抗体浓度的增加而降低。3. NKG2A和NKG2D也可以在NKT细胞及T细胞上表达。但NKG2A在外周血NK细胞、NKT细胞及T细胞上的表达依次降低；NKG2D在外周血T细胞上的表达显著低于NK细胞和NKT细胞。4.CRC患者外周血CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞均比健康对照显著升高,但与淋巴结转移、临床分期不相关。5.在CRC患者和健康对照外周血中,CD4+CD25highFoxp3+细胞水平均显著高于CD4+CD25lowFoxp3+细胞水平。6.CRC患者上调的CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞水平与下调的NKG2D+NK细胞水平无统计学相关性。7.CRC患者CD4+CD25+Foxp3+及CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞水平与血清CEA水平之间未发现统计学相关性,尽管一些严重的进展期CRC患者Treg细胞和血清CEA同时增高。结论：结直肠癌患者抑制性受体NKG2A和活化性受体NKG2D在转录水平及翻译水平的表达失衡,可能与NK细胞活性抑制相关。我们推论CRC肿瘤细胞可以经由NKG2路径逃避NK细胞免疫监视；然而,其潜在的机制需要进一步探究。CRC患者外周血免疫抑制性Treg细胞表达显著增高,而外周血NKG2D+NK细胞表达显著降低,但均与CRC患者是否合并淋巴结转移及临床分期不相关。受到研究样本量的限制,在上调的Treg细胞与下调的NKG2D+NK细胞之间我们未发现显著的统计学相关性；在Treg细胞与血清CEA水平之间也未发现统计学相关性。需要更多研究以探明Treg细胞与NKG2D+NK细胞参与结直肠癌免疫逃逸的机制。