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几丁质酶是一种作用于几丁质产生N-乙酰葡萄糖胺和几丁寡糖的水解酶,可用于几丁质的生物转化和生物防治植物病原真菌病害。本实验室在生物菌肥苜蓿链霉菌ACCC40021全基因组测序及CAZy分析的基础上,发现其存在唯一的糖苷水解酶19（GH19）家族的几丁质酶SaChi19B。本课题研究了该几丁质酶的酶学性质,并评估了其在几丁质生物转化和生物防治植物病原真菌的效率;利用蛋白质工程技术,进一步提高了其抗植物病原真菌的作用。1、本研究对该GH19几丁质酶基因进行了克隆,并在E.coli BL21（DE3）中高效表达。SaChi19B的最适pH为8.0（磷酸缓冲液）,最适温度为45℃,具有良好的pH和温度稳定性;通过底物特异性试验表明,其具有广泛的底物谱,对乙二醇几丁质、胶体几丁质和α-几丁质有较高的活性;通过SaChi19B作用方式的TLC分析表明:其属于内切几丁质酶;通过SaChi19B和SaHEX协同作用于虾壳几丁质试验表明,其在8小时达到最大转化率,GlcNAc产率为95.19%,纯度大于98%;通过抗植物病原真菌试验表明,SaChi19B对6种主要的植物病原真菌均有抑制作用,对灰葡萄孢、立枯丝核菌抑制最强。以上结果首次证明GH19几丁酶可作为生物催化剂,用于转化晶体几丁质;同时,该几丁质酶可作为生防制剂,应用于防治植物真菌病害。2、为了探索一种简单有效的提高几丁质酶SaChi19B的活性及抗真菌活性的策略,我们成功构建了CatDChi19B（仅有催化结构域）、rChi19B（含N-端几丁质结合结构域）、DChBDChi19B（含两端几丁质结合结构域）三种形式的酶,并在E.coli BL21（DE3）中得到了高效表达;与CatDChi19B和rChi19B相比,DChBDChi19B显著地提高了对α-几丁质、胶体几丁质和黑曲霉几丁质的结合能力和活性;同时增强了其对病原真菌长枝木霉的抑制作用,证明了简单的两端融合表达ChBD能够显著地增强几丁质酶对不同几丁质的活性和抗真菌活性。3、为了进一步提高几丁质酶SaChi19B抗真菌活性和广谱性,我们通过无缝克隆的方法在SaChi19B的C端融合壳聚糖酶SaCsn,成功构建了融合酶SaChi19B-Csn,并在E.coli BL21（DE3）中得到了高效表达。融合酶SaChi19B-Csn的最适温度为30℃,最适pH为8.0（磷酸缓冲液）;通过底物特异性试验表明:该酶显示出广泛的底物谱,尤其是对几丁质和壳聚糖具有较高活性。抗真菌试验表明:SaChi19B-Csn与原始的几丁质酶SaChi19B相比,不仅提高了对所有测试的植物致病真菌的效率,而且扩大了抗真菌谱。