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目的:hp0521基因是I型H.pylori携带的cag致病岛中2号基因,目前国内外对其研究仅仅停留于序列多样性及对Cag A转运和IL-8的影响。本实验针对H.pylori hp0521基因的多样性和功能,从生物信息学、分子生物学等方面研究其在H.pylori致病机制中的作用。方法:1.对H.pylori NCTC11637及临床菌株hp0521基因和cag A基因3,端可变区PCR扩增,测序。使用生物信息学软件分析hp0521基因基本理化性质、系统进化树构建等方面,同时探讨hp0521基因型与cag A可变区序列之间联系。2.依据HP菌株OM6004 hp0521基因,体外合成菌株26695补全两个碱基后CDS(coding sequence),构建表达载体p ET-32a-hpc0521和p ET-32a-hp0521,Western Blot分析IPTG诱导表达的融合蛋白。3.分析H.pylori 26695和NCTC11637 hp0521基因序列抗原决定簇,合成具有强抗原性的多肽并免疫获得抗体,测效价。4.Western Blot验证HP菌株26695中hp0521基因编码的Cag2蛋白表达情况。5.构建p Blue KM40-(35)hp0521::kan自杀质粒,电击转化,抗性筛选,PCR及测序验证,获得缺失株△hp0521。6.测定相应时间点的OD值,比较野生株26695和缺失株△hp0521生长情况。7.提取野生株26695和缺失株△hp0521总RNA,逆转录,PCR法比较下游基因hp0522、hp0523极化情况。8.网站预测及文献查找hp0521互作基因,设计RT-PCR引物,比较其在m RNA水平上变化。9.Western Blot验证野生株26695和缺失株△hp0521中其他重要cag PAI编码蛋白的稳定性。10.进行HP与细胞共培养实验,探讨Cag A转运和IL-8分泌两者与hp0521基因缺失的关系。结果:1.获得HP菌株hp0521基因和cag A基因3,端可变区序列;hp0521基因编码理化性质稳定且无信号肽的Cag2蛋白,结构元件以无规则卷曲和α螺旋为主;Cag2蛋白与DNA拓扑异构酶I同源,有介导细胞壁延伸等蛋白标签;进化树分析分别获得其同源菌株。2.成功合成H.pylori 26695补全碱基后的CDS;成功构建原核表达载体p ET-32a-hpc0521和p ET-32a-hp0521;成功验证hpc0521基因转录翻译Cag2蛋白。3.成功制备效价是1:2.56×105的兔抗Cag2蛋白多克隆抗体。4.用制备的抗体,Western Blot证明H.pylori菌株26695 hp0521基因在菌体内不转录翻译为Cag2蛋白。5.成功构建自杀质粒p Blue KM40-(35)hp0521::kan;成功电转化获得缺失株:(35)hp0521。6.绘制野生株26695和缺失株△hp0521生长曲线,确定hp0521基因不影响菌株生长情况。7.确定hp0521基因缺失后不影响hp0522、hp0523基因转录。8.获得hp0521互作基因为hp0116、hp0333、hp0440、hp0515、hp0516、hp0520、hp0792、hp1293、hp1324、rpo B、cag A、vac A、ure A、fla B,经RT-PCR确定hp0521基因缺失后cag A、rpo B的m RNA水平上调。9.hp0521基因缺失后,cag PAI编码的Cag A蛋白表达量增加,Cag X、Cag M、Cag L、Cag S、Cag I、Cag V、Cagζ蛋白稳定性无影响。10.与GES-1共培养,缺失hp0521基因后Cag A转运和IL-8诱导无明显变化。结论:1.通过克隆、测序及分析了解HP菌株hp0521基因编码的Cag2蛋白具有DNA拓扑异构酶功能区,同时一般hp0521基因缺失的HP菌株cag A基因普遍携带EPIYA-D基序。2.H.pylori 26695 hp0521基因因缺失两个碱基后终止密码子提前导致其不编码Cag2蛋白。3.hp0521基因缺失对H.pylori的生长、对其他cag PAI编码蛋白的稳定性、对Cag A转运及IL-8诱导分泌无影响。4.hp0521基因可能与cag A、rpo B相互作用,且hp0521基因可能抑制Cag A蛋白的表达。