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目的：本研究采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），利用pRNS-1质粒将温度敏感型猿猴病毒40大T抗原基因（temperature sensitive simian virus40 large T antigen gene，tsSV40LTag）转染大鼠BMSCs，获得温度敏感型永生化的BMSCs。观察在不同温度条件下，温度敏感型BMSCs的增殖情况。在亚低温条件下，将其移植至颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）大鼠颅内，观察其对损伤神经功能恢复的影响。
方法：（1）大鼠原代。BMSCs的分离、培养：分离新出生10 d内幼鼠的双侧股骨和胫骨，剪开长骨两端骨皮质，露出骨髓腔，用低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，然后接种到塑料培养皿中，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下细胞培养箱中培养。在倒置相差显微镜下观察细胞贴壁生长，至第14天单层贴壁细胞接近90％融合时，按1：2传代。以后随细胞增殖均80％～90％融合时，按1：2持续体外传代培养。（2）大鼠BMSCs表面标志的鉴定：在细胞悬液中，分别加入适量FITC标记CD29、CD31、CD44、CD45、CD90抗体及CD34单克隆抗体进行荧光标记。流式细胞仪进行检测。（3）BMSCs的溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记：取第5代BMSCs以1×105/ml进行细胞爬片，在细胞生长融合前48 h、36 h、24 h、12 h掺入BrdU，使终浓度为10μmol/L，并分别孵育至细胞融合，测定BrdU的最佳标记时间。BrdU标记的BMSCs进行免疫荧光染色。（4）pRNS-1质粒转染BMSCs以及阳性克隆的筛选和扩增：pRNS-1质粒按照脂质体LipoVecTM说明书进行转染，48 h后将细胞移至33℃，用含G418的培养基进行筛选。将筛选后的细胞传代扩增。（5）RT-PCR检测BMSCs中tsSV40LTag的表达：用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，按反转录试剂盒说明书将细胞的RNA反转录成cDNA后进行PCR扩增。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。（6）测定33℃和37℃两种温度下tsSV40LTag-BMSCs生长曲线。（7）实验分组与亚低温治疗：随机将54只成年雄性SD大鼠分为对照组、亚低温治疗组、亚低温+tsSV40LTag-BMSCs移植组。除对照组外所有实验动物接受亚低温治疗，对照组大鼠进行常规处理。（8）制备大鼠液压TBI模型：各实验组大鼠使用液压冲击脑损伤仪制备大鼠中型TBI模型。（9）大鼠颅内移植tsSV40LTag-BMSCs：在亚低温条件下，采用立体定向引导，向移植组大鼠颅内进行多点移植tsSV40LTag-BMSCs。（10）TBI大鼠神经运动功能评分：分别于伤后第1天、7天、14天、21天、28天，由同一位不参与实验分组的评价者在相应日期的同一时间对实验组大鼠进行神经运动功能评分。
结果：（1）大鼠原代BMSCs的分离、培养：骨髓细胞悬液接种到塑料培养皿，1 d后可见部分细胞贴壁，此后贴壁细胞不断扩增，第14天细胞汇集成片，进行传代。扩增至第5代时，细胞形状趋于一致，呈梭形。（2）BMSCs表面标志的鉴定：经流式细胞仪检测，体外培养至第5代的细胞表面标志CD29、CD44、CD90呈阳性，CD31、CD34、CD45呈阴性，证实体外培养的细胞为BMSCs。（3）BMSCs的BrdU标记：48 h作为最佳标记时间，细胞标记阳性率>94％。（4）pRNS-1质粒转染BMSCs的筛选结果：筛选14 d后可见转染细胞集落形成，未转染细胞全部死亡。（5）RT-PCR检测tsSV40LTag已转染至BMSCs中。（6）在33℃和37℃两种温度下tsSV40LTag-BMSCs的生长情况：在33℃时，tsSV40LTag-BMSCs生长增殖速度较快，在体外培养条件下可连续传代增殖。37℃时，细胞生长增殖速度明显减慢，甚至停止生长。（7）大鼠液压TBI模型制备结果：各实验组死亡率比较无统计学差异（P>0.05）。（8）TBI大鼠神经运动功能评分结果：大鼠脑创伤后第1天评分无统计学差异（P>0.05），说明创伤模型的神经运动功能障碍程度较一致。伤后第7天、14天、21天、28天，各实验组的神经运动功能评分随时间有上升趋势且亚低温+tsSV40LTag-BMSCs移植组上升更明显，即神经运动功能障碍得到改善，颅脑创伤呈现康复趋势。亚低温治疗组、亚低温+tsSV40LTag-BMSCs移植组的神经运动功能评分均比对照组有明显改善；亚低温+tsSV40LTag-BMSCs移植组的神经运动功能评分比亚低温治疗组有明显改善。说明在亚低温条件下，移植tsSV40LTag-BMSCs对改善TBI大鼠神经运动功能优于亚低温治疗组。
结论：在亚低温介导下移植tsSV40LTag-BMSCs治疗TBI大鼠，能够明显改善大鼠脑创伤所致的神经运动功能障碍。为tsSV40LTag-BMSCs移植治疗TBI提供了实验依据，为进一步实验研究及临床试验提供了理论依据。