研究背景：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是软骨组织工程中倍受关注的种子细胞,具有很高的研究意义和广泛的应用前景。但应用BMSCs构建的软骨组织经体内长期移植后,会发生一系列表型不稳定现象,比如丧失表达Ⅱ型胶原的能力,这些严重地影响利用BMSCs进行软骨缺损的长期修复效果。这一系列表型变化现象类似于软骨内骨化的发生过程,即软骨组织先出现肥大、钙化现象,并伴随有血管的侵入,随着体内移植时间的增长血管化程度逐渐增加,渐渐矿化形成骨组织。该过程中血管化的侵入是诱导软骨向骨转变的关键步骤。然而正常的软骨组织在促血管发生的微环境中,仍可持续保持无血管的状态及稳定的软骨表型,经研究发现,其中存在的一种特异性的生长因子——软骨调节素-1(Chondromodulin-I, ChM-I),具有强效的抑制血管发生的功能。我们推测BMSCs在分化为软骨的过程中ChM-I不表达或者表达很低,从而才会导致血管侵入、软骨表型丢失现象的发生。目前,对BMSCs及其分化形成的软骨中ChM-Ⅰ是否表达尚无文献报道。因此,我们从ChM-I基因在BMSCs和软骨细胞中是否存在表达差异出发,研究ChM-I对BMSCs体内构建的软骨血管化的抑制作用,分析其在软骨表型丢失过程的影响。实验目的：观察软骨细胞对BMSCs体内构建软骨的血管化的抑制作用,对比抗血管生成因子ChM-I的基因在两种细胞间的表达差异,并探讨ChM-I抑制BMSCs体内构建软骨血管化的作用,为改善和提高BMSCs来源的软骨组织的表型稳定性提供新的思路。实验方法和结果：1. BMSCs与软骨细胞以不同比例(3：1,1：1,1：3)混合,接种至珊瑚材料上,移植到裸鼠皮下,同时分别以单纯BMSCs和软骨细胞为阴性和阳性对照组,体内培养1-2个月后,观察构建的组织工程软骨的血管化程度,并分析抗血管生成因子ChM-I在不同组中的表达分布。大体观察和组织学结果可见,单纯BMSCs构成的组织中血管化程度很高,而且有少量成骨出现。相反,含有软骨细胞的各实验组均可形成血管化程度极低的软骨组织,在软骨细胞含量很少(25%)时也可保持很低的血管化水平。免疫荧光结果显示,ChM-I在阳性对照组及各个实验组都有不同程度的表达分布,而单纯BMSCs构成的组织中没有。2.用RT-PCR的方法比较ChM-I基因在BMSCs和关节软骨细胞之间的表达差异。结果显示ChM-I在BMSCs中几乎不表达,此外,两种细胞之间Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达也存在显著的差异。3.获得兔ChM-I基因克隆,构建重组腺病毒Ad5-ChM-I。用RT-PCR的方法从兔的关节软骨组织中获得了ChM-I基因克隆,通过测序验证了其正确性,并成功的构建了高滴度的重组腺病毒Ad5-ChM-I。4.转染重组腺病毒Ad5-ChM-I的BMSCs与珊瑚材料复合物移植到裸鼠皮下1-2个月后,观察体内构建的软骨组织的血管化的程度,分析软骨表型的变化。大体观察和组织学结果可见,转染Ad5-ChM-I的BMSCs在体内形成的软骨组织的血管化程度很低,免疫荧光结果显示,ChM-I在转染后的BMSCs形成的组织中有一定的表达分布。结论：研究结果表明,ChM-I基因在BMSCs和软骨细胞中确实存在显著的表达差异,BMSCs中几乎不表达ChM-I,软骨细胞及其特异性表达的ChM-I均可以抑制BMSCs体内构建的软骨组织的血管化发生,阻止其向骨的表型发生转变,在一定程度上稳定了软骨表型。因此,我们可以将腺病毒介导的ChM-I基因修饰的BMSCs作为新型的种子细胞,用于构建稳定的无血管侵入的组织工程软骨,或者用于软骨缺损修复之中,达到长期的治疗效果。