背景：　　吗啡是目前最常用、也是最经典的强效镇痛药物，然而在慢性疼痛患者治疗中，由于长时间应用吗啡后容易产生药物耐受或依赖，从而影响了它的临床镇痛效果；或由于长时间、大剂量（耐受形成后使用剂量不断加大）使用后，相应的便秘、尿潴留、呼吸抑制等副作用增加，目前吗啡耐受的确切机制仍不清楚。哈佛医学院疼痛研究中心的Mao等[1,2]研究显示中枢神经系统细胞的凋亡参与了吗啡耐受形成过程中脊髓的神经可塑性（neuroplasticity）改变。　　长期以来，凋亡一直被认为是细胞程序性死亡的唯一方式。近十年来大量文献显示除凋亡外，还存在另外一种细胞程序性死亡方式，这就是自噬(autophagy)。学者们 Rikiishi等[3]将首先发现的细胞程序性死亡方式-凋亡称为第一类程序性细胞死亡（Type I Programmed Cell Death），自噬则称为第二类程序性细胞死亡（Type II Programmed Cell Death）。自噬是维持细胞稳态、保护细胞的一种机制。正常的自噬活性能阻止受损细胞器、有聚集倾向的蛋白堆积所产生的毒性作用；而过度的自噬可导致细胞生存所必须的成分都降解，可能引起细胞死亡。目前有许多动物模型证明应激相关信号，神经细胞损伤，神经病理性病变等可引起快速的自噬泡的积聚，而神经细胞内蛋白大量积聚会导致细胞器损伤、突触功能失调、神经细胞退行性病变，甚至细胞死亡，提示自噬在许多中枢神经系统疾患中扮演重要角色[4-7]。自噬是否也参与吗啡耐受形成过程的调节，尚未见文献报道。　　既往研究显示，阿片受体脱敏、内吞和受体下游信号转导的调控是吗啡耐受形成的可能原因[8]。既往研究表明G蛋白偶联受体激酶（GPKs），蛋白激酶C（PKC），依赖cAMP蛋白激酶（PKA），有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK），磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、AKT等相关信使均参与了吗啡耐受的形成[8,9]。大量研究显示上述信号通路或信使分子也参与了自噬形成过程的信号调节；其中以哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）为中心环节的PI3K-Akt-mTOR是最重要的信号通路[10]。　　我们推测吗啡耐受形成与自噬调节相关的信号通路存在交叉对话（crosstalk）；吗啡耐受形成过程脊髓自噬状态也发生改变，且自噬作为另一种程序性死亡方式也能对吗啡耐受的形成过程具有调节作用。　　本研究拟通过鞘内注射吗啡建立慢性吗啡耐受模型，采用免疫组织化学和Western blot方法检测吗啡耐受形成过程不同时点脊髓背角自噬蛋白的的表达，并应用mTOR抑制剂雷帕霉素调节自噬，观察其对吗啡耐受形成的影响，探讨自噬在吗啡耐受形成中的作用。　　第一部分：鞘内注射吗啡诱导脊髓背角自噬状态的改变　　目的：　　研究鞘内注射吗啡诱导吗啡耐受过程中大鼠脊髓背角自噬状态的变化。　　方法：　　选择鞘内置管成功的成年雄性SD大鼠64只，随机分为M组和C组（n=32），M组每天2次，连续7天鞘内注射吗啡20μg；C组每天2次，连续7天鞘内注射生理盐水。于鞘内注射前及第1、3、5、7天第2次鞘内注药后30min采用电子Von Frey测痛仪测定机械缩足反射阈值（MWT），然后随机取4只大鼠L4-6脊髓背角采用Western blot测定自噬标记蛋白LC3 II(LC3II/LC3I)及自噬调节信号相关蛋白Beclin-1的表达，随机取4只大鼠L4-6脊髓背角采用免疫组织化学方法检测Beclin-1的表达。　　结果：　　鞘内注射吗啡7天后，吗啡镇痛作用明显下降（62.3％），提示出现吗啡耐受形成。Western blot结果：C组各时点LC3 II及Beclin-1均有少量表达，各时点比较无显著差异；与C组比较，M组各时间点脊髓背角Beclin-1、LC3II表达量及LC3II/LC3I比值均显著上调（P<0.05）； M组内不同时点比较，第1天 LC3II/LC3I比值最高（（P<0.05）），随后逐渐下降；第1天 Beclin-1表达最高（P<0.05)，随后下降，在第5天后表达量趋于稳定。免疫组织化学结果：C组各时间点脊髓背角Beclin-1表达平均光密度值（OD值）无明显差异（P>0.05）。M组内不同时点比较，第1天Beclin-1表达量最高（P<0.05），随后逐渐下降，第5天与第7天差异无统计学意义。　　结论：　　鞘内注射吗啡可诱导脊髓背角自噬增加，Beclin-1可能参与鞘内注射吗啡诱导所致的自噬状态改变。　　第二部分：脊髓背角自噬调节对吗啡耐受形成的影响　　目的：　　研究鞘内注射自噬增强剂雷帕霉素对大鼠吗啡耐受形成的影响。　　方法：　　选择鞘内置管成功的成年雄性SD大鼠32只，随机分为M组、C组、MR组和R组（n=8），M组每天2次，连续7天鞘内注射吗啡20μg；C组每天2次，连续7天鞘内注射生理盐水；MR组每天2次，连续7天鞘内注射吗啡20μg，并于第3天第2次注射吗啡同时鞘内注射自噬增强剂雷帕霉素2.3μg，连续3天；R组每天2次，连续7天鞘内注射生理盐水，并于第3天第2次注射生理盐水前鞘内注射雷帕霉素2.3μg，连续3天。于鞘内注射前及第1、3、5、7天第2次鞘内注药后30min采用电子Von Frey测痛仪测定机械缩足反射阈值（MWT），最后一次MWT测定结束后随机取4只大鼠L4-6脊髓背角采用Western blot测定自噬标记蛋白LC3 II(LC3II/LC3I)及自噬调节信号相关蛋白Beclin-1的表达，随机取4只大鼠L4-6脊髓背角采用免疫组织化学方法检测Beclin-1的表达。　　结果：　　与M组比较，MR组鞘内注射第3、5、7天后MWT均升高（P<0.05），虽然MR组MWT有降低趋势，但在第7天MWT仅比第1天下降43%，表明第3天后雷帕霉素与吗啡合用能部分逆转吗啡耐受的形成。Western blot结果：与C组比较，M组、R组和MR组第7天脊髓背角Beclin-1、LC3II与LC3II/LC3I表达均上调（P<0.05）。与M组比较，R组和MR组第7天脊髓背角Beclin-1、LC3II与LC3II/LC3I表达显著上调（P<0.01）。免疫组织化学结果：与M组比较，第7天MR组脊髓背角Beclin-1表达平均光密度值明显升高（P<0.01）。　　结论：　　吗啡耐受开始形成时合用自噬增强剂雷帕霉素可以部分逆转脊髓吗啡耐受的形成。