猪耳性状是一个重要的表观特征,不同品种间相差很大。纵然人先天性外耳畸形的遗传学研究已有多次报道,但其遗传机理尚未被解析。猪是一个生理特性与人非常接近的重要模式动物。对猪耳性状的遗传解析不仅可以为品种选育提供参考,也可以为人外耳畸形的研究提供临床借鉴。国内外关于5号染色体(SSC5)上影响猪耳面积大小QTL的研究已有多篇文献报道,但其真正的因果基因和因果突变并未被鉴别。本研究前期利用猪60K SNP芯片在白色杜洛克×二花脸资源家系F2和苏太猪中进行了 GWAS分析,将QTL区间精细定位至632.722 kb,该区间包含LEMD3、MSRB3和HMGA2三个候选基因。本研究在此基础上,利用60K SNP芯片在莱芜猪、二花脸猪和杜长大(DLY)商业猪三个群体中进行全基因组扫描并进行GWAS分析。结果在莱芜猪中,关联性最强 SNP 为 ASGA0025241、ASGA0025245、H3GA0016181 和 ALGA0031527;二花脸猪中最强相关SNP是位于SSC7上的ALGA0040227,并未在SSC5上定位到显著相关SNP;在DLY商业猪中最强相关SNP为ASGA0025245和ASGA0025241。我们将这三个研究群体以及前期所用到的F2资源家系和苏太猪共五个群体合并进行Meta-GWAS分析,结果在SSC1、4、5、7、13和X染色体上均定位到了基因组显著水平SNP,其中最强相关SNP是SSC5上的ASGA0025245。随后采用GWAS最高点的LOD值下降2和r2≥0.8的方法确定QTL置信区间,结果在F2、苏太猪、莱芜猪和DLY四个群体中QTL置信区间分别确定为471.75kb、1.09Mb、1.11 Mb和709.61 kb。结合这四个群体的QTL区间,最终将SSC5上影响猪耳面积大小的QTL区间精细定位至471.75 kb (32.97 Mb- 33.44 Mb)。在大耳猪单倍型共享分析中,本研究使用了 4头二花脸猪、6头民猪、3头五指山猪和3头藏猪1.18 Mb区间内共118个SNP构建单倍型,结果发现所有的大耳品种共享345.54 kb (32.76 - 33.10 Mb)和235.29 kb(32.52-32.76 Mb)两个区间。再结合GWAS结果,本研究最终将QTL区间精细定位至138.05 kb (32.97-33.10 Mb)内。该区间包含MSRB3基因的第2-7外显子以及下游15.14 kb区间,因此MSRB3是最有可能的因果基因。本研究通过分析MSRB3的mRNA序列发现,该基因具有6个不同转录本,其中只有转录本2能够编码正常的蛋白质,此外在MSRB3上并未发现有错义突变。本研究用qPCR检测这6个转录本以及周围的HMGA2和LEMD3两个基因在QQ和qq个体中的表达,发现均没有表达差异。本研究也做了 MSRB3在不同QTL基因型个体中的western blot和免疫组化,结果显示MSRB3在不同QTL基因型个体之间的蛋白表达差异显著。利用重测序数据分析了该QTL区间的结构变异,在所有资源家系F0二花脸母猪中发现了一个约38.4 kb大小的重复序列,该重复序列包含了 MSRB3基因的最后两个外显子。通过qPCR检测该CNV拷贝数,发现其拷贝数变异与所有已知QTL基因型或者大小耳表型完全相符,表明这个CNV极有可能是因果突变。本研究将该CNV作为固定效应进行GWAS分析时,SSC5上的信号完全消失,说明CNV解释了所有的QTL效应。通过与GWAS的最高点相比,CNV解释的表型变异在苏太、莱芜和DLY中更大。由于在QQ和qq个体中MSRB3基因的mRNA水平没有差异而蛋白水平有差异,说明可能存在其它的因素抑制MSRB3基因的翻译。有趣的是,本研究在CNV的3’下游附近发现了一个miR-584,软件预测结果显示该miRNA在MSRB3的3’UTR上具有结合位点。本研究做了 miR-584在不同QTL基因型个体中的表达情况,结果有表达差异,并且和western blot结果相对应。为了确认真正的因果突变,本研究筛选了 CNV到miR-584之间所有的SNP,结果并未发现与QTL基因型或者表型完全一致的SNP。根据以上这些结果,本研究将MSRB3确定为SSC5上影响猪耳面积大小的主效基因,位于MSRB3基因内的CNV确定为影响猪耳面积大小的因果突变。本研究的发现可以为人小耳畸形疾病的遗传学研究提供新的参考和研究思路。