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猕猴桃溃疡病对于猕猴桃产业来说是一种具有毁灭性的细菌性病害。目前,猕猴桃溃疡病在中国、意大利、新西兰等国家严重发生,严重制约着猕猴桃产业的发展。丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)是猕猴桃溃疡病的病原菌。其中phaseolotoxin毒素是猕猴桃溃疡病发生的一个关键因素。然而,该毒素对猕猴桃溃疡病菌致病机制的影响尚未明确。因此我们通过转座子诱变的方法得到phaseolotoxin毒素合成丧失突变株,克隆得到phaseolotoxin毒素相关基因,明确了猕猴桃溃疡病菌基因中phaseolotoxin毒素相关基因的功能,为揭示phaseolotoxin毒素致病机制的研究奠定基础。研究内容如下:1.猕猴桃溃疡病菌Tn5突变体库的构建以猕猴桃溃疡病菌产phaseolotoxin毒素菌株AHP18为材料,利用EZ-Tn5<R6K gori/KAN-2>Tnp Transposome转座系统,在电压1200 V/cm的条件下电击5 ms,将含有卡那抗性基因的EZ-Tn5转座子插入到AHP18的基因组中,构建猕猴桃溃疡病菌的Tn5插入突变体库,共获得254株突变株。通过在含卡那霉素50μg/m L的LB平板上连续继代培养7代,初步确定Tn5稳定插入到猕猴桃溃疡病菌的基因组中。2.Phaseolotoxin毒素合成丧失突变株的筛选根据筛选获得的最佳产毒体系,及利用在M9培养基中,初始浓度OD600为0.1,18℃培养48 h,获得EZ-Tn5突变株和AHP18野生型菌株的粗提取物。利用室内平板Escherichia coli生长抑制试验方法初筛得到毒素合成丧失突变株19株。为了进一步确定毒素合成丧失突变株,我们利用冷冻干燥浓缩手段将获得的突变株产生的粗提取物进行浓缩,运用E.coli生长抑制试验和TLC吸附层析方法进行复筛,最终筛选得到6株phaseolotoxin毒素合成丧失和减弱的突变株。3.猕猴桃溃疡病菌phaseolotoxin毒素丧失突变株的鉴定根据已报导的引物Psa F1/Psa R2,Psa F3/Psa R4对获得的突变株进行双重PCR检测,结果表明在175 bp和280 bp位置处出现两条目的条带,确定突变株是由野生型菌株突变而来;根据EZ-Tn5转座子的特有序列,设计转座子特异性引物对EZ-Tn5F(AGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAG)/EZ-Tn5R(AACATCATTGGCAAC GCTACCT),对获得的突变株进行转座子特异性PCR,通过PCR获得1060 bp的目的片段,从而验证了EZ-Tn5稳定插入到毒素合成丧失突变体的基因组中。4.Tn5插入失活基因的克隆及其序列分析根据转座子EZ-Tn5两端的序列,设计3对嵌套引物,同时依据物种蛋白质普遍存在的保守氨基酸序列设计简并引物,采用TAIL-PCR方法扩增转座子插入位点的侧翼序列。以毒素合成丧失突变株AHP1846,AHP1879的基因组DNA为模板,用简并引物和嵌套引物组成的引物组合进行TAIL-PCR扩增。结果表明利用左端引物LSP1,LSP2,LSP3从突变株AHP1846基因组中克隆得到293 bp的序列。对获得的侧翼序列利用DNAStar、DNAMAN以及NCBI网站上的BLAST等生物信息学软件进行分析。结果与P.syringae pv.actinidiae公布的glm S基因同源性为100%,该基因编码6-磷酸果糖谷氨酰胺氨基转移酶(L-glutamine:D-fructose-6-phosphate aminotransferase,简称GFAT)。根据已公布的猕猴桃溃疡病菌和其他革兰氏阴性细菌的glm S基因的保守区设计引物对GF/GR,以猕猴桃溃疡病菌野生型菌株AHP18的基因组为模板,获得了1836 bp的片段。结果发现与P.syringae pv.actinidiae公布的glm S基因同源性为100%,确定侧翼序列位于glm S基因的916-1133的位置处。为了验证EZ-Tn5转座子在毒素丧失突变株AHP1846的基因组中插入的拷贝数,我们根据转座子序列设计探针引物TZF/TZR,DNA探针利用地高辛标记,将AHP1846的基因组DNA经过HindⅢ限制性内切酶消化后通过Southern杂交法来分析。Southern杂交结果得到一条单一的条带,表明转座子EZ-Tn5在AHP1846的基因组中为单拷贝插入。5.转座子插入失活基因对猕猴桃溃疡病菌致病性的影响利用针刺注射法将突变株AHP1846和AHP1879和野生型菌株AHP18接种烟草,结果表明插入失活基因菌株AHP1846以及突变株AHP1879均未诱导烟草产生过敏性反应,而野生型菌株AHP18对烟草诱导出明显的过敏症状。通过摩擦接种法接种猕猴桃离体和活体的叶片,结果表明插入失活基因菌株AHP1846以及突变株AHP1879对猕猴桃叶片丧失致病力,而接种野生型菌株AHP18的叶片出现典型的褐色斑。通过创伤接种法接种猕猴桃离体和活体的嫩枝,结果2个突变株均丧失致病力,而接种野生型菌株的嫩枝在接种部位变褐。结果表明插入失活基因对猕猴桃溃疡病菌致病力有影响,glm S基因功能的丧失导致了猕猴桃溃疡病菌致病力的丧失。