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登革病毒属于黄病毒家族，是一种有包膜的单链RNA病毒，它包括四种不同的血清型，分别为DV1、DV2、DV3和DV4。登革病毒感染引起的症状较为复杂，从没有明显或者是仅有轻度症状的登革热，到病势凶险伴有多种综合症状的登革出血热和登革休克综合征。在过去的几十年中，该病毒以埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊为媒介昆虫，在全世界热带和亚热带地区大面积流行，据世界卫生组织报道，每年全世界有近1亿人感染DV，其中以与我国接壤的东南亚地区流行最为严重。DV感染已经成为一个越来越严重的公共卫生问题，它正时刻威胁着人类的健康。但遗憾的是，迄今为止DF和DHF/DSS的致病机制尚未完全阐明。
本研究的主要结果和结论如下：
一、Rab8截短体蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备
首先，采用RT-PCR方法从HepG2细胞总RNA中T-A克隆了人Rab8基因，构建了pMD19T-Rab8质粒，针对Rab8蛋白的C端122个氨基酸设计一对亚克隆引物，以pMD19T-Rab8质粒为模板，用PCR扩增和BamH I/HindIII双酶切方法将Rab8-122的DNA片段定向亚克隆到原核表达载体中，构建了原核表达质粒pQE31-Rab8-122。该质粒经双酶切和测序检验构建的准确性。
随后，对含有pQE31-Rab8-122质粒的工程菌诱导表达，1 mM IPTG诱导4 h即可获得以包涵体形式表达的目标蛋白。用Ni亲和层析、pH梯度洗脱和透析的方法纯化目标蛋白。用抗His抗体可以检测到Western blot反应膜上的目标蛋白，其大小约为15 kDa，与预期大小一致。
最后，用获得的Rab8截短体蛋白免疫动物制备抗Rab8多克隆抗体。经ELISA检测，制备的抗血清效价达1:20000。Western blot实验证明，1:500稀释的自制兔抗Rab8抗体，能够与诱导表达的6xHis-Rab8-122蛋白以及HepG2细胞中分子量约为24 kDa的内源性Rab8蛋白发生特异的抗原抗体反应。Rab8抗血清的成功制备为后续研究奠定了基础。
二、Myo5c截短体蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备
首先，根据My05c特异性的α-螺旋区设计引物，采用RT-PCR方法从人胃黏膜组织总RNA中获得目标片段，用BamH I/Sal I双酶切方法将My05c-297片段的DNA编码序列定向克隆到原核表达载体，构建了原核表达质粒pQE31-Myo5c-297。该质粒经双酶切和测序检验构建的准确性。
用1 mM IPTG对含有pQE31-My05c-297质粒的工程菌诱导表达。获得的目标蛋，用Ni亲和层析、pH梯度洗脱和透析的方法纯化。用抗His抗体可以检测到Western blot反应膜上的目标蛋白，其大小约为42 kDa，与预期大小一致。
最后，用获得的Myo5c截短体蛋白免疫动物制备抗Myo5c多克隆抗体。经ELISA检测，制备的抗血清效价达1:12800。Western blot实验证明，1:500稀释的自制小鼠抗Myo5c抗体，能够与诱导表达的6xHis-Myo5c-297蛋白以及HepG2细胞中分子量约为20.kDa的内源性Myo5c蛋白发生特异的抗原抗体反应。1:200稀释的Myo5c抗血清还能检测人结肠黏膜切片中Myo5c抗原。Myo5c抗血清的成功制备为后续研究奠定了基础。
三、Rab8参与2型登革病毒复制周期
1、Rab8和DV2在HepG2细胞内高度共存
DV2感染HepG2细胞，胞内的Rab8分布并没有出现非常显著的改变，仍然分布于核周到细胞膜之间的区域。但是在胞内点状分布的DV2抗原位置也有明显相同点状的Rab8抗原存在。用激光共聚焦分析这些点状结构，发现Rab8与DV2高度共存，其共存率大于90％。这提示，Rab8可能参与DV2感染细胞的过程。
2、稳定表达Rab8正、负突变体HepG2细胞的建立
为进一步研究Rab8在DV复制周期中的作用，我们利用脂质体法分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rab8Q67L和pcDNA3.1-Rab8T22N超纯质粒转染至HepG2细胞，经过筛选，成功地获得具有G418抗性的细胞株，分别命名为HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN，经流式细胞计数法鉴定Rab8正、负突变体在HepG2RabsAM和HepG2Rab8DN细胞中的表达，证明所构建的细胞株可用于后续实验研究。
3、表达Rab8正、负突变体导致DV2阳性细胞数减少
免疫荧光染色发现：DV2感染HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞后24h，大约有60％的HepG2p3.1细胞表现为病毒抗原阳性，而HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞中则最多有20％-30％的细胞呈现为病毒抗原阳性。这说明，表达Rab8正、负突变体影响到DV2感染细胞的过程。
4、表达Rab8正、负突变体导致培养上清中的子代病毒的释放减少
利用空斑实验，在DV感染后不同时间点检测HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞培养上清中病毒滴度发现：在感染后8 h，三者所产生的子代病毒没有显著变化；但在感染后24和48 h，以HepG2p3.1细胞为对照，HepG2Rab8AM细胞培养上清中子代病毒分别减少了97.0％和82.2％；同样HepG2Rab8DN细胞培养上清中子代病毒分别减少77.2％和53.3％。这表明Rab8正、负突变体的表达能够抑制子代DV的释放；且较之于Rab8负突变体， Rab8正突变体作用更为显著。
5、表达Rab8正、负突变体抑制胞内侵染性病毒颗粒的产生
同样利用空斑实验，在感染后8、24和48 h，检测HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞内病毒滴度发现：在感染后8 h，三者胞内合成的侵染性病毒颗粒没有显著变化；但在感染后24和48 h，HepG2p3.1细胞胞内的DV2颗粒随着感染时间的延长而迅速增加；与之相比较，表达Rab8正突变体Rab8Q67L分别使胞内病毒滴度降低了96.4％和78.8％；表达Rab8负突变体Rab8T22N也分别使胞内病毒滴度降低了86.4％和80.2％。这表明Rab8正、负突变体的表达，能够抑制细胞内侵染性病毒颗粒的产生，Rab8可能是HepG2细胞中参与DV2成熟过程的重要宿主因子。
6、表达Rab8正、负突变体能够抑制病毒RNA复制
为进一步阐明表达Rab8正、负突变体使细胞内DV2产生减少的原因，在DV2感染后不同时相点，利用real-time RT-PCR方法，检测了HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞中DV2 NS1基因的相对水平。我们发现感染后24和48 h，表达Rab8正突变体Rab8Q67L分别使胞内病毒RNA降低了51％和28.5％；表达Rab8负突变体Rab8T22N也分别使胞内病毒RNA降低了33％和36％。结果表明，表达Rab8正、负突变体可在一定程度下调病毒RNA复制。
7、表达Rab8正、负突变体抑制病毒进入HepG2细胞
利用病毒进入的实验方法，检测了进入HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞的病毒颗粒数量发现：与对照相比较，表达Rab8正突变体Rab8Q67L抑制81.3％病毒进入，表达Rab8负突变体Rab8T22N可抑制79.7％病毒进入细胞。结果表明，Rab8参与了DV2进入HepG2细胞的过程。
四、Myo5c参与2型登革病毒释放
1、Myo5c tail稳定表达细胞株的建立
首先构建了Myo5c tail真核表达质粒pCI-Myo5c-tail，以pCI-neo空载体为对照，用脂质体法转染HepG2细胞，利用筛选培养基获得具有G418抗性的细胞株，分别命名为HepG2pCI和HepG2Myo5c-tail。Western Bolt检验结果显示，用鼠抗Myo5c抗血清可以检测到HepG2pCI和HepG2Myo5c-tail细胞中内源性的Myo5c蛋白，大小约为20.kDa，而在HepG2Myo5c-tail细胞中除了可以检测到内源性的Myo5c蛋白外还可以检测到转染pCI-Myo5c-tail质粒表达的Myo5c tail蛋白，大小约为93 kDa。
2、HepG2细胞中Myo5c可能与Rab8存在相互关联
间接免疫荧光双染色法结果表明，Rab8和Myo5c均分布于核周到细胞膜区域，共聚焦分析两者共存率在局部区域高达90％。说明在HepG2细胞中Myo5c与Rab8高度共存。
用流式细胞免疫染色计数法检测发现，HepG2Myo5c-tail训细胞中内源性Rab8表达量相对于HepG2pCI细胞增加近一倍。提示Myo5c tail的表达，可能导致HepG2细胞内源性Myo5c功能受到抑制，胞内Rab8的量出现代偿性增加。
3、Myo5c间接调控病毒释放
间接免疫荧光双染色结果显示，在感染后24 h，Myo5c和DV2抗原虽然均出现在核周和胞浆内，但共聚焦分析表明两者共存率很低，提示Myo5c和DV2之间可能不存在直接的相互作用关系。