论文部分内容阅读
目的: 乙型病毒性肝炎患者免疫学指标的定量检测对临床上乙肝疾病的病情诊断、监测和疗效观察起到了重要作用。本课题旨在建立液相芯片技术联合定量检测人血清乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（hepatitisB e antigen，HBeAg）、抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体(antibodyto hepatitis B surface antigen，AHBs)、抗乙型肝炎病毒e抗原抗体(antibody tohepatitis B e antigen，AHBe)、抗乙型肝炎病毒核心抗原抗体(antibody to hepatitisB core antigen，AHBc)试剂盒。 方法: 1.液相芯片技术定量检测乙肝五项方法的建立 本课题采用双抗体夹心法检测人血清中的HBsAg和HBeAg，血清中的抗原与偶联微球的捕获抗体和生物素标记的检测抗体结合形成免疫复合物，然后加入藻红蛋白（R-phycoerythrin，PE）标记的链亲和素(streptavidin，SA)，样本中抗原量的多少与荧光强度成正比。本课题采用竞争法检测血清中的AHBs、AHBe和AHBc。血清中的抗体与偶联微球的捕获抗体竞争结合中和抗原，经洗涤，结合微球的中和抗原再与生物素标记的检测抗体结合形成免疫复合物，加入PE标记的SA，样本中抗体量的多少与荧光强度成反比。 因此本课题首先将抗HBsAg、HBeAg和HBcAg捕获抗体分别共价偶联到带有COOH活化基团的不同编码的微球表面，将三种检测抗体分别进行生物素标记。初步建立液相芯片技术定量检测乙肝五项的方法。然后从偶联抗体用量、微球用量、生物素标记抗体稀释度以及反应时间等方面进行优化，确定最佳反应条件，最后检测三种指标的交叉反应性，建立液相芯片技术联合检测乙肝五项的方法。 2.液相芯片技术定量检测乙肝五项方法的方法学评价 对建立的液相芯片技术定量检测乙肝五项方法进行方法学评价。评价指标包括标准曲线建立、检测范围、检出限、精密度、回收实验和干扰实验。对80份健康体检者血清进行五项指标的检测确定其正常参考范围，对150例临床样品进行检测，并与化学发光免疫分析方法（chemiluminessent immunoassay，CLIA）结果进行比较。 结果: 1.液相芯片技术定量检测乙肝五项方法建立 本课题成功将HBsAg、HBeAg和HBcAg三种指标的捕获抗体偶联到不同编码的微球表面，并成功将其检测抗体进行生物素标记。优化液相芯片技术定量检测乙肝五项指标最佳实验条件为:三种指标的捕获抗体偶联微球的抗体最佳使用量分别为为10μg、8μg、6μg/1.25×106microspheres;微球用量分别为2000个/孔、500个/孔、500个/孔;生物素标记抗体稀释度分别为1∶100、1∶50、1∶50;样品反应时间为60min;生物素标记抗体反应时间为45min; SA-PE反应时间为10min。HBsAg与HBeAg和HBcAg之间无交叉反应，而HBeAg和HBcAg之间存在较强的交叉反应。因此本方法采用HBsAg和HBeAg联合检测、AHBs和AHBe联合检测、AHBc单检测形式进行乙肝五项的联合检测。 2.液相芯片技术定量检测乙肝五项方法的方法学评价 此法方法检测乙肝五项的检测范围如下:HBsAg检测范围为0.09-186.60IU/mL; HBeAg检测范围为0.20-320 PEIU/mL; AHBs检测范围为0.90-9000.00mIU/mL; AHBe检测范围为0.05-5000.00 PEIU/mL; AHBc检测范围为1.60-26.40PEIU/mL。建立五参量Logistic标准曲线的r2值分别为0.9992，0.9997，0.9999，0.9990，AHBc标准曲线r2值为0.9630。最低检出限分别为为0.02 IU/mL，0.11PEIU/mL，0.22mIU/mL，0.01 PEIU/mL，1.30 PEIU/mL。批内不精密度为2.07％-15.56％，批间不精密度为2.59％-17.48％;本方法回收率为90.89％-116.42％。血红蛋白≤15g/L、胆红素≤0.4g/L，甘油三酯≤3g/L对本方法检测无显著干扰。 本方法检测乙肝五项正常参考范围结果如下:HBsAg参考区间上限为0.4IU/mL，HBeAg参考区间上限为0.6 PEIU/mL，AHBs参考区间上限为10mIU/mL，AHBe参考区间上限为10 PEIU/mL，AHBc参考区间上限为5 PEIU/mL。本方法检测人血清乙肝五项结果与CLIA检测结果比较，其检出率相同。 结论: 本课题成功建立液相芯片技术联合定量检测人血清乙肝五项方法，此方法具有较宽线性范围，较好灵敏度，较好精密度，初步评价其方法可以应用于临床人血清乙肝五项定量检测，本方法的建立为临床定量检测人血清乙肝五项指标提供一种新的选择。