背景胰腺癌作为一种恶性程度非常高的消化道肿瘤,具有早期病例难以确诊,缺乏有效治疗手段以及极高的病死率等特点,是名副其实的“癌中之王”。细胞自噬是与凋亡并列的一种真核细胞程序性死亡形式,在胰腺癌乏氧乏血供的特殊肿瘤微环境中,胰腺癌细胞的自噬水平是明显上升的,并可能会通过一些尚未明确的机制影响胰腺癌的发生发展和对药物治疗的反应。本课题组已发现EHF（又名ESE3,是ETS转录家族中的一员）在胰腺癌中起着抑癌转录因子的作用,会负向调控胰腺癌的EMT（上皮间质转化）过程,提示EHF可能和胰腺癌细胞的干性特征也存在负向的关系。在本课题预实验中通过RNA测序发现EHF与P62（又名SQSTM1,中文名为选择性自噬接头蛋白）存在表达上的正相关性,P62的表达又与自噬水平的高低息息相关,而自噬在已有的研究中也被认为会影响肿瘤细胞的干性强弱。但是EHF是否真的会影响胰腺癌细胞的干性表达,以及自噬是否参与了这个过程,并且充当了怎样的角色,这些问题目前尚未有人进行过相关研究。因此,我们设计本实验旨在探讨自噬与EHF是否会影响胰腺癌细胞的干性表达水平,以及二者在这个过程中是否存在关联,并明确其中的作用机制,在此基础上希望可以进一步寻求通过影响自噬与EHF的作用而对胰腺癌的治疗起到促进作用的新方法。方法1.体外培养本课题组常用的6种人源胰腺癌细胞系,并收集它们的蛋白质和RNA,通过Western Blot实验和RT-qPCR实验挑选出EHF表达量相对较低和较高的各两种细胞,随后合成EHF过表达和降表达的病毒液,并对之前筛选出的实验细胞进行EHF表达量的对应稳定过表达和降表达。随后继续通过Western Blot实验和RT-qPCR实验对构建的稳定细胞系进行验证。验证成功后,利用流式细胞术的方法检测胰腺癌细胞中ESA、CD24以及CD44三种指标均为阳性的细胞所占整体细胞的数量百分比,同时利用悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验共同分析胰腺癌细胞中EHF表达水平对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响。2.提取EHF过表达细胞系和对照组细胞系的RNA,并送至生物测序公司进行RNA序列测序实验,分析在mRNA水平EHF与P62的表达关系。收集96名在天津医科大学肿瘤医院接受了胰腺癌根治术的患者的肿瘤组织蜡块,利用免疫组化染色实验,通过对组化切片中的染色情况进行评分量化,利用卡方检验分析EHF与P62在肿瘤组织中的表达情况,并收集患者对应的临床病理和预后信息,利用Kaplan-Meier生存曲线分析EHF与P62的表达水平与患者无复发生存及总生存之间的关系,同时观察EHF与P62在细胞中的分布情况。在胰腺癌肿瘤组织标本库中随机挑选8对癌与癌旁的配对组织,并分别提取组织的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在组织水平研究EHF与P62之间的关系。提取EHF过表达和降表达细胞系及对应对照细胞系的蛋白质和RNA,同样利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平研究EHF与P62之间的关系。最后利用ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验探索EHF作为转录因子是否通过转录调控的作用影响P62的表达。3.提取EHF过表达和降表达细胞系及对应对照细胞系的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平研究EHF与胰腺癌细胞自噬水平之间的关系。4.构建过表达和降表达P62的胰腺癌稳定细胞系,并在此基础上构建EHF和P62同时过表达和降表达的稳定细胞系,连同之前已经构建成功的单独过表达和降表达EHF的稳定细胞系和对照细胞系,分别提取这些细胞系的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平验证稳系构建效果并进一步探讨EHF和P62的上下游关系。在此基础上利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析P62对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响以及它对于EHF可能存在的反馈性影响作用。5.利用胰腺癌组织切片和胰腺癌细胞体外爬片分别进行免疫荧光染色实验,通过对EHF和P62的同时染色,观察在组织水平和细胞水平二者在空间上是否存在共定位的关系。通过co-IP实验探究EHF与P62在细胞体内是否存在蛋白质之间的相互作用。利用细胞内的核浆蛋白分离实验分析P62是否会影响EHF在细胞内的分布。通过双荧光素酶报告基因实验探索P62是否会影响EHF的转录调控活性。6.利用GST pull-down实验探究EHF与P62是否在细胞体外存在直接的蛋白之间的相互作用。通过NCBI数据库搜索组成EHF与P62的主要结构域的碱基序列,并针对这些结构域构建附加HA或Flag标签的外源性质粒,通过瞬时转染的方法将包含各结构域及标签蛋白的质粒导入工具细胞293T内,利用co-IP实验和Western Blot实验分析EHF与P62之间的相互作用是由各自的哪个结构域进行承担的。7.利用mTOR抑制剂Rapamycin对胰腺癌细胞进行自噬水平的诱导提高,并利用Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术对自噬诱导情况进行检测。通过Western Blot实验和核浆蛋白分离实验分析在自噬水平升高的情况下对于EHF和P62的总量以及各自在细胞内的分布存在怎样的影响。利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析自噬对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响。通过双荧光素酶报告基因实验探索自噬是否会影响EHF的转录调控活性。8.在给予Rapamycin诱导自噬的情况下,通过外源瞬时转染P62过表达质粒,构建回复实验模型,并行的通过小干扰RNA分别有效降低P62和EHF的表达量,构建阻断实验模型,利用Western Blot实验和RT-qPCR实验验证模型构建是否成功,并通过Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术对自噬诱导情况进行检测。利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验、软琼脂克隆形成实验以及双荧光素酶报告基因实验分析自噬是否确实通过P62-EHF这条通路影响胰腺癌细胞的干性表达水平。9.利用生物信息学的KEGG信号通路分析和GSEA基因富集分析寻找EHF调控胰腺癌细胞干性强弱的信号通路。利用Western Blot实验和RT-qPCR实验对筛选出的通路进行上下游的初步验证。再利用有效的信号通路抑制剂构建阻断实验模型,验证模型构建成功后,利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析EHF是否确实通过筛选出的信号通路影响胰腺癌细胞的干性表达水平。10.利用EHF过表达的病毒液,构建胰腺癌鼠源细胞系Pan02过表达EHF的稳定细胞系和空白对照细胞系,并对C57BL/6小鼠进行腹股沟区皮下成瘤实验,随后分别给予生理盐水和明确的自噬抑制剂ULK-101进行治疗,观察分析自噬抑制剂对于胰腺癌的治疗作用以及EHF是否可以成为筛选出更好响应自噬抑制剂治疗的患者的生物标志物。在此基础上利用胰腺癌的PDX细胞进行NGS小鼠的皮下成瘤实验,随后分别给予生理盐水、吉西他滨、自噬抑制剂ULK-101以及吉西他滨和ULK-101合用的治疗,观察分析自噬抑制剂和胰腺癌治疗中常用化疗药联合使用在控制胰腺癌发展中的作用情况。结果1.通过对本课题组常用6种人源胰腺癌细胞系进行EHF表达量的检测,挑选出EHF表达量相对较低的PANC-1和MIA PaCa2细胞构建EHF过表达的稳定细胞系,挑选出EHF表达量相对较高的BXPC-3和SW1990构建EHF降表达的稳定细胞系。通过流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验可以发现EHF具有负向调控胰腺癌细胞干性特征的能力。2.通过RNA测序结果分析发现,EHF与P62在mRNA水平的表达情况存在正相关性。通过免疫组化染色的结果分析发现,EHF与P62在细胞的核与浆中均有分布,而且二者具有染色强度同增同降的趋势,通过染色后评分的统计学分析证实二者表达量的正相关性也是具有统计学意义的,并且二者均对患者的生存起到了保护的作用。通过在体内胰腺癌肿瘤组织以及体外胰腺癌细胞的蛋白水平和RNA水平进行相关实验检测均提示EHF与P62呈表达量正相关的关系。通过数据库分析,发现在P62基因的启动子区具有EHF可能潜在结合的区域,通过染色质免疫共沉淀实验证实EHF确实会结合到P62的启动子区,通过双荧光素酶报告基因实验证实EHF与P62启动子区的这种空间上的结合会最终增强P62的转录活性。3.EHF并不会影响胰腺癌细胞的自噬水平。4.EHF作为转录因子确实会影响P62的表达水平,但是P62作为下游基因并不会影响EHF的表达。P62同样具有负向调控胰腺癌细胞干性特征的能力,但是其影响能力不如EHF的作用大,考虑P62可能以辅助EHF的作用负向调控胰腺癌细胞的干性特征。5.通过对胰腺癌肿瘤组织的切片和胰腺癌细胞体外爬片分别进行免疫荧光发现,EHF与P62确实在细胞的胞核和胞浆中均有分布,而且二者的表达水平呈正相关性,并且两种蛋白在空间存在共定位表现。通过co-IP实验进一步证实在胰腺癌细胞内EHF与P62存在蛋白质之间的相互作用。利用细胞的核浆蛋白分离实验发现,P62在不影响EHF蛋白总量的情况下会影响EHF在细胞内的分布。6.通过GST pull-down实验证实EHF与P62存在直接的蛋白质相互作用。通过构建组成EHF与P62的各主要结构域的且带有特殊标签蛋白的质粒,并利用转染293T工具细胞后的co-IP实验发现EHF通过PNT结构域与P62的ZZ结构域进行结合。7.通过Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术证实mTOR抑制剂Rapamycin确实可以有效提高胰腺癌细胞的自噬水平。而自噬水平提高后并不会影响EHF的总量但会减少P62的总量进而影响EHF在细胞内的分布,并且会降低EHF的转录调控能力,最终正向调控胰腺癌细胞的干性特征。8.通过回复实验和阻断实验证实自噬通过影响P62-EHF这条通路影响胰腺癌细胞的干性特征是有统计学意义的。9.通过生物信息学分析以及Western Blot实验的验证,EHF确实会负向调控Wnt/β-catenin信号通路的活性,利用阻断实验证实EHF会通过调控Wnt/β-catenin信号通路的活性从而有效的影响胰腺癌细胞的干性特征。10.通过对小鼠动物模型植瘤后的治疗实验发现,自噬抑制剂可以有效控制胰腺癌细胞在体内的发展,这种控制效果在EHF表达量高的肿瘤组织中更为明显,而且自噬抑制剂和传统的胰腺癌化疗用药吉西他滨联合使用呈现出对胰腺癌控制加成的作用。结论1.EHF在胰腺癌中是具有抑癌作用的转录因子,对于患者的生存起到了保护的作用,并且可以负向调控胰腺癌细胞的干性特征。2.EHF可以正向转录调控P62的表达,而P62会通过蛋白质之间直接相互作用的方式影响EHF在细胞核中的分布量进而影响EHF的转录调控活性,最终形成正反馈环共同影响胰腺癌细胞的干性特征。3.自噬通过降低P62的表达量进而减少EHF在细胞核中的分布量,最终通过减弱EHF的转录活性,造成下游Wnt/β-catenin信号通路被激活从而提升胰腺癌细胞的干性特征。4.自噬抑制剂可以有效控制胰腺癌细胞的发展程度,和化疗药物吉西他滨联用效果更佳,EHF过表达的胰腺癌细胞对于这种治疗的响应更为明显。