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目的:FVB小鼠具有繁殖力强、受精卵大、前核显著、易于显微注射DNA等优点,成为实验室常用动物模型,并广泛用于转基因实验,比如转运蛋白敲除型Bcrpl(-/-)、Mrpl(-/-)、Mrp2(-/-)和Mdrla(-/-)。在药物处置过程中,Ⅰ和ⅡI相代谢反应在胞内生成代谢产物并由外排转运蛋白转至胞外。药物代谢酶和外排转运蛋白共同控制药物的清除,限制药物的生物利用度。目前,转运蛋白敲除型小鼠广泛用于药代动力学研究,但是,有关敲除是否对代谢酶会产生影响的研究未见报道。另外,临床研究表明,药物代谢酶和转运蛋白的性别差异可以导致药动学和药效学的改变。逆转录聚合酶链式反应法(Reverse-transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)及免疫印迹法(Western blotting,WB)常应用于药物代谢酶基因、蛋白水平的测定。尽管这些方法广泛运用,但是,这些方法存在准确度差和低通量等局限性。因此,本文旨在建立并优化一种快速、灵敏、稳定和高通量的非同位素标记质谱绝对定量法并运用于测定雌雄野生型FVB、转运蛋白敲除型Bcrpl(-/-)、Mrpl(-/-)、Mrp2(-/-)和 Mdrla(-/-)五种小鼠不同代谢组织中 27 种药物代谢酶的表达情况,为药物的研发和临床安全用药提供可靠的理论依据。方法:采用差速离心法制备组织S9片段。建立探针多肽质谱检测方法及方法学验证。样品经胰蛋白酶水解后采用固相萃取后进行UHPLC-MS/MS检测,考察雌雄野生型 FVB、Bcrp1(-/-)、Mrp1(-/-)、Mrp2(-/-)和 Mdrla(-/-)小鼠不同组织中药物代谢酶的表达情况。结果:1.快速、灵敏、稳定和高通量的UHPLC-MS/MS蛋白定量法方法学验证结果表明,本研究方法专属性良好;所有多肽在1.56-200 nM均具有良好线性关系;质控样品在低、中、高浓度下准确度到达78.6%、75.0%和96.4%;所有多肽精密度到达要求;基质效应均在可接受范围;所有样品三天的稳定性均符合要求;质控样品的回收率均在70%-120%范围内。上述实验结果说明,本课题成功建立了一-种快速、灵敏、稳定和高通最的UHPLC-MS/MS蛋白定量法。2.药物代谢酶在5种基因型小鼠不同组织的蛋白表达结果显示,DMEs广泛分布于代谢组织,其中肝脏含量最高。肝脏中表达的DMEs 有 Cyp1a2、Cyp1b1、Cyp2c29、Cyp2c39、Cyp2d22、Cyp2e1、Cyp3a11、Cyp3a25、Cyp7a1、Cyp27a1,Ugt1a1、Ugt1a2、Ugt1a5、Ugt1a6a、Ugt1a9、Ugt2a3、Ugt2b1、Ugt2b5、Ugt2b34、Ugt2b35、Ugt2b36、Su1t1a1、Sultld1、Sult3a1;其中 Cyp2c29,Ugt2b5 和 Sult1a1 含量最高。小肠中表达的 DMEs有Cyp1b1、Cyp2c29、Cyp3a11、Cyp3a25、Cyp7a1,Ugt1a1、Ugtla2、Ugt1a5、Ugt1a6a、Ugt2a3、Ugt2b5、Ugt2b34、Ugt2b35、Sult1b1、Sult1d1、Sult2b1;其中 Cyp3a11、Ugt1a1 和 Sult1d1含量最高。分布于肾脏的 DMEs 有 Cyplb1、Cyp2e1、Cyp7a1、Ugt1a2、Ugt2a3、Ugt2b5、Ugt2b35、Sult1d1、Sult4a1;其中 Cyp2e1 和 Sult1d1 在雄性小鼠均最高,Ugt2b5和Ugta2分别在雌性小鼠中含量最高;胃中表达的DMEs包括Cyp1b1、Cyp7a1、Ugt1a2、Ugt1a5、Ugt1a6a、Ugt2a3、Ugt2b5、Ugt2b34、Sult1b1,除Ugt2b5表达较高外,其余DMEs均处低水平表达。小鼠肺部、脑部、脾脏和心脏中分布的DMEs较少,同时含量较低。3.药物代谢酶在雌雄小鼠主要代谢器官的性别差异结果显示,虽然有些亚型在不同小鼠中性别差异不一致。但是,也存在一部分在所有小鼠性别差异一致的亚型。肝脏中雄性占主导的DMEs有Cyp2c29、Cyp1a2、Cyp27a1、Ugt2b1、Ugt2b5 和 Ugt2b36;雌性占主导的有:Cyp2c39、Cyp2d22、Cyp7a1、Ugt1a1、Ugt1a5、Sult1a1、Sult3a1 和 Sult1d1;小肠中雄性占主导的DMEs有Cyp2c29和Cyp3a11;肾脏中雌性占主导的DMEs有Cyp2e1、Ugt1a2 和 Sult1d1。4.药物代谢酶在转运蛋白敲除型小鼠和FVB小鼠体内含量变化情况结果显示,绝大部分药物代谢酶在5种小鼠不同脏器中的蛋白表达水平相近。但是,我们发现有些药物代谢酶在5种小鼠部分组织中蛋白水平相差较大。肝脏中,四种敲除型雄性小鼠Cyp2c29和Ugt1a9的蛋白表达升高至2倍左右;雄性Mrp1(-/-)、Mrp2(-/-)小鼠Cyp3a11蛋白表达升高至1.5倍左右。小肠中,雄雌Mrp1(-/-)和Mrp2(-/-)小鼠中Cyp2c29蛋白表达升高至2.5倍左右。雌雄小鼠脾脏中Ugt1a2的蛋白表达水平升高至2倍左右。雄性敲除小鼠肾脏中Ugt2b5的蛋白表达下降至0.5倍左右;雄性敲除小鼠胃脏中Sult1b1的蛋白表达下降至0.4倍左右。结论:本课题成功建立了一种快速、灵敏、稳定和高通量的UHPLC-MS/MS蛋白定量法,同时运用于测定雌雄野生型FVB、转运蛋白敲除型Bcrp1(-/-)、Mrpl(-/-)、Mrp2(-/-)和Mdrla(-/-)五种基因型小鼠不同代谢器官中药物代谢酶的表达。同时,药物代谢酶在小鼠性别和代谢器官表达的研究将为为进一步研究药物代谢酶的作用提供理论依据。