鳜鱼ISKNV诱导蛋白1和NDPK基因的克隆、表达分析及重组蛋白表达

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鳜鱼是我国重要的养殖品种,而近年来传染性脾肾坏死病毒对鳜鱼养殖造成了严重的经济损失。为了研究病毒与宿主的相互作用,在ISKNV感染鳜鱼的抑制性消减杂交cDNA文库基础上,经NCBI数据库比对分析后挑出ISKNV诱导蛋白1、核苷二磷酸激酶(NDPK)、胰蛋白酶原、细胞色素C氧化酶亚基、铁蛋白亚基等5个克隆进行初步研究。通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功获取了以上克隆的全长cDNA序列。   以基因组DNA为模板,扩增了IIP-1和NDPK两个基因的序列,弄清其基因的结构皆由五个外显子和四个内含子构成。经生物信息学分析在IIP-1蛋白N端可能存在30aa的信号肽,在C端有一个跨膜区;蛋白含有RGD基序,有PKC、CK2、TRY等磷酸化位点和糖基化位点,推测其为能与整合素作用接受外界信息从而参与信号传导途径的一个膜蛋白。   为了进一步研究基因功能,用半定量RT-PCR研究了以上两个基因在ISKNV感染鳜鱼后的不同时段、不同组织内的时空表达模式。研究表明,在鱼体受到ISKNV感染后IIP-1mRNA表达水平大幅上调,在头肾、后肾、心脏、肝脏、脑部、脾脏、鳃、卵巢中广泛存在,其中卵巢含量最高且表达恒定;NDPK在鱼体受到ISKNV感染后mRNA表达水平下降,但下降幅度不大,且回复快;同样在头肾、后肾、心脏、肝脏、脑部、脾脏、鳃、卵巢中广泛存在,卵巢含量最高且表达恒定。   为研究蛋白功能建立基础,便于将来寻找相互作用蛋白,进行了IIP-1和NDPK的重组表达。以pET-32a、pRSETA、pQE30等三种原核表达载体成功构建了5种重组质粒pET-IIP、pRSET-IIP、pQE-IIP、pET-NDPK、pRSET-NDPK,转化BL21(DE3)和M15后获得了目的蛋白的高效表达。
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