棉花(Gossypium hirsutum)是最重要的天然纤维作物,在我国民经济中占有重要地位。纤维的生长发育受包括多植物激素信号的多途径网络的控制。DELLA蛋白,是GA信号途径中关键的负调控因子,其N末端能够响应GA信号;C末端具有GRAS域,参与转录调节。由于缺乏典型的DNA结合结构域,DELLA蛋白通常与其它调控蛋白结合,通过影响这些蛋白的功能而起作用。乙烯作为一种重要的植物激素,能促进陆地棉纤维细胞的伸长。EIN3(Ethylene insensitive 3)是乙烯信号转导途径中重要的核转录因子,调控植株的生长发育,并作为乙烯与其他信号间交叉点发挥重要作用。本实验从DELLA蛋白的互作蛋白入手,研究DELLA在纤维生长发育过程中的作用。一方面,在全面鉴定棉花GhEIN3基因的基础上,分析其进化、分类、表达以及与DELLA蛋白的互作,进一步用烟草瞬时表达分析两种蛋白的互作对下游基因表达的影响。另一方面,我们构建了陆地棉开花后10天和20天的纤维cDNA文库,利用DELLA做诱饵从文库中筛选互作蛋白,并通过瞬时表达进行验证。主要结果如下:1.诱饵蛋白的构建和筛选陆地棉存在4对DELLA基因,分别来自A亚基因组(GhGAI1A~4A)和来自D亚基因组(GhGAI1D~4D)。首先用GhGAI1D~4D的全长或截短序列构建酵母双杂交(Y2H)的诱饵载体,检测其自激活和细胞毒性。结果表明,Gh GAI1D和3D蛋白的C端GRAS区以及GhGAI1D的N区没有自激活作用和细胞毒性。进一步检测表明8个棉花DELLA蛋白的C端GRAS区均无自激活和细胞毒性,因此采用DELLA蛋白的C端GRAS区进行后续的用于文库筛选和蛋白互作检测。2.在陆地棉中DELLAs和GhEIN3s互作的全面分析从陆地棉中鉴定出7对GhEIN3基因(Gh EIIN3-1A~7A,GhEIN3-1D~7D),其编码蛋白都具有EIN3的典型结构域。表达分析表明4对GhEIN3基因(GhEIN3-1A~4A,GhEIN3-1D~4D)在棉花中有明显表达,且在不同组织和纤维不同时期的表达模式相似。乙烯处理能显著上调体外培养纤维中GhEIN3-1A、1D、2D和3D的转录。瞬时表达发现所有的GhEIN3s都能显著激活含EBS(EIN3-binding site)的启动子,而且不同GhEIN3s对不同启动子的激活效率存在差异。说明GhEIN3可能在纤维发育中起着重要调控作用。将GhEIN3-1~4A/D构建在AD载体上,和8个棉花DELLA的GRAS域的BD载体,两两进行酵母双杂交,实验发现GhEIN3-1A与所有DELLA存在相互作用,而其他GhEIN3s不能与DELLA互作。在瞬时表达系统中,DELLA的互作抑制GhEIN3-1A对靶基因的激活作用。DELLA通过与GhHOX3互作,可以抑制GhHOX3与pEXPA1和pRDL1的结合从而抑制基因表达。瞬时表达发现GhEIN3-1A与DELLA的互作不能回复GhHOX3对EXPA1和RDL1的激活作用。说明DELLA与GhEIN3-1A的互作可能对DELLA下游HOX3调控途径无明显影响。3.DELLA互作蛋白的筛选以GhGAI1D-GRAS为诱饵,在棉花开花后10天和20天的纤维cDNA文库中筛选潜在互作蛋白,并通过共转化和烟草瞬时表达验证验证蛋白间的互作。最终鉴定出两个阳性的DELLA互作蛋白:C4类锌指蛋白FYVE-D和CCCH类锌指蛋白ZinCX8-D。烟草瞬时表达和双荧光酶活检测实验发现,GhHOX3激活pEXPA1和pRDL1的表达,DELLA蛋白(GhGAI1D)与GhHOX3互作抑制GhHOX3的激活作用,而FYVE-D和ZinCX8-D与DELLA互作,可以解除DELLA对GhHOX3的抑制,回复GhHOX3对靶基因的激活作用。因此FYVE-D和ZinCX8-D可能通过与DELLA互作影响DELLA下游HOX3途径基因的表达。