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哺乳动物卵巢卵母细胞发育的研究,最初主要关注生殖细胞形成的早期阶段或出生后卵泡的生长发育。然而,至今为止,对原始卵泡的形成以及卵泡生长的启动与选择的调控机制还了解很少。虽然小鼠原始卵泡可以体外培养发育并可获得成熟的卵母细胞,但减数分裂前的雌性生殖细胞不能在体外完成这一过程。鉴于此,本试验以家兔和小鼠为模型动物,来筛选一种简便、易行的卵巢卵母细胞体外发生的培养体系,进行卵母细胞的体外发生研究。
本研究分析了在完全体外条件下,小鼠卵巢卵母细胞的分化与发育能力。机械法分离12.5dpc胎鼠卵巢,并将胎鼠卵巢去除中肾组织后贴壁培养28d,分析小鼠卵母细胞体外发生与卵巢卵母细胞体内正常发育之间的差异,研究结果发现,小鼠减数分裂前的雌性生殖细胞体外培养可发育成平均直径为75μm左右的卵母细胞,培养2d后,卵巢组织开始贴壁,第10d,卵母细胞形态开始出现,第26d时,卵母细胞平均直径增大到70μm以上,体外培养最后得到的卵母细胞平均直径可以达到75μm,而体内正常发育的卵泡平均直径能达到84.7μm,两者差异显著(P<0.05)。另外,体外培养了22d的卵巢卵泡直径可达到90μm以上,颗粒细胞1.6±0.2层,细胞数目为32±2.6个,与体内发育的卵泡相比差异显著(P<0.05),但体外发育的卵母细胞的特异基因表达与正常小鼠的没有显著差异。此外,体外培养的卵母细胞不能完成减数分裂,因为只有体内发育成熟的卵母细胞有pERK1/2表达,而体外培养的卵母细胞不表达。
本研究根据家兔卵巢卵母细胞的体内发育特征初步探讨了家兔卵巢卵母细胞体外发育的培养体系。采集30日龄家兔卵巢在不同培养条件下长期培养,分析家兔卵母细胞的体外发生与家兔卵巢卵母细胞体内正常发育之间的差异,来优化家兔卵巢卵母细胞的体外培养体系。本试验从基础培养液、FSH浓度、BSA/血清等方面来筛选较好的培养条件,结果表明:使用DMEM/F12+α-MEM为基础培养液培养的卵巢的卵母细胞数最多(17.4±3.5个/卵巢),直径最大(63±3.2μm),与其它组相比差异显著(P<0.05);添加血清的培养液培养的卵巢的卵母细胞数(16.7±2.9个/卵巢)与卵母细胞直径(60.2±3.3μm)比添加BSA的培养液效果好,差异显著(P<0.05);家兔卵巢组织在FSH浓度为50mIU/ml的培养液中生长较好,卵母细胞数量多(18.5±2.8个/卵巢),直径较大(65±2.3μm),与其他组相比,差异显著(P<0.05)。新生兔卵巢组织在DMEM/F12+α-MEM和10%FCS培养液培养到28d时,卵母细胞直径平均可达到56±2.3μm,每个卵巢组织上的卵母细胞数量平均为16±3.6个。