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随着全球化贸易的发展以及转基因技术的应用,我国近年来在玉米相关领域的国际贸易越来越频繁,导致玉米褪绿斑驳病毒等检疫性有害生物以及转基因蛋白随玉米种子传入的风险也越来越大。因此如何简便快捷地检测出进口玉米中的检疫性病毒以及其他产品中的转基因蛋白具有重要的意义。本课题利用SPR生物传感器,对玉米褪绿斑驳病毒和转基因抗虫蛋白cry1F的检测进行了研究。
本课题包括三个部分。首先以健康玉米叶为原材料,对玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)进行了繁殖和纯化,然后经小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选与克隆以及腹水抗体制备与纯化过程获得了纯化的玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体,并对其进行了效价测定、亚类鉴定、特异性分析以及灵敏度研究。然后,基于表面等离子共振生物传感器检测方法,对纯化的玉米褪绿斑驳病毒的检测进行了研究。优化了相关检测条件,对病毒检测的灵敏度和特异性进行了研究;并且在优化条件下对携带玉米褪绿斑驳病毒的实际玉米样品的检测进行了研究。最后,利用SPR生物传感器对Bt抗虫蛋白cry1F的检测进行了研究。
主要研究成果如下:
(1)获得了纯化的玉米褪绿斑驳病毒,浓度为10mg/mL。获得了1株命名为1C5能稳定分泌抗MCMV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,效价为1×106,IgG1亚类,经G蛋白柱纯化的单克隆抗体的浓度为0.46mg/mL。该单抗特异性很好,能检测携带玉米褪绿斑驳病毒的玉米病汁液的最大稀释倍数为6400倍。
(2)建立了检测MCMV的SPR方法。确立了检测MCMV的最优条件:SPR芯片抗体固定时间3h、抗体固定浓度200μ g/mL、抗体固定温度37℃、抗体固定pH6、进样流速10μ1/min、检测温度20℃、检测pH7.4。该检测方法具有很好的特异性,重复性较好,最低检测限为1ng/mL,并且能够检测实际带病玉米样品,检测时间15min。
(3)建立了检测cry1F蛋白的SPR方法,进行的特异性和灵敏度实验表明该方法具有很好的特异性,重复性好,检测灵敏度为10ng/mL。