自凝聚标签与SPM融合表达载体的构建及重组牛γ干扰素的表达与纯化

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重组蛋白纯化是蛋白功能研究和药物研发的重要环节。目前常用的重组蛋白纯化方法主要有亲和层析法,其纯化效率较高,但不仅需用昂贵的亲和树脂、难以规模化,而且常需用蛋白酶切除标签蛋白,而蛋白酶不仅价格昂贵,还需用其他方法将其从终产物中去除,使得重组蛋白纯化进一步复杂化和增加额外成本。因此,建立简单、经济的重组蛋白纯化方法是生物制药研究领域迫切需要解决的问题,对兽用重组蛋白更是如此。  脑膜炎奈瑟球菌FrpC蛋白自加工元件(self-processing module,SPM)由250个氨基酸组成,在钙离子诱导下能进行FrpC蛋白Asp414/Pro415位点自体剪切。本课题组将SPM自剪切活性与类弹性蛋白多肽(ELP)的温度敏感可逆相变特性相结合,建立了简单、经济的重组蛋白表达与纯化方法。自装配肽(Self-assembling peptide)能在菌体内自然形成类似包涵体的结构,但其融合表达产物具有活性,可用离心法进行分离纯化。本研究将SPM与自凝聚标签相结合,建立了更为简单、经济的重组蛋白表达与纯化方法,并成功用于牛重组γ干扰素(BoIFNγ)的表达与纯化。  将16个氨基酸组成的β自装配肽ELK16编码序列优化成大肠杆菌偏爱密码子序列,N端引入17个脯氨酸(P)或苏氨酸(T)组成的PT连接头。将人工合成的PT16序列插入pET-30a载体。用高保真PCR扩增SPM编码序列,与PT16序列同框融合,构建得融合表达载体pSPM-PT16。将BoIFNγ成熟肽序列插入SPM-PT16融合标签上游,将重组载体pBoIFNΥ-SPM-PT16转化BL21(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白表达。通过对培养基、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间等条件的系统优化,使融合蛋白获得有效表达。通过对离心力、Triton X100洗涤浓度和尿素变性/复性等条件的优化,分离纯化的融合蛋白纯度达92.7%,回收率达70.4%。利用钙离子诱导融合蛋白自剪切,用离心去除SPM-PT16融合标签,获得的重组BoIFNγ纯度达94.9%。以水泡性口炎病毒为指示病毒,在MDBK细胞上进行病变抑制试验,结果显示重组BoIFNγ效价为103U/mg蛋白。
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